多顺反子：IRES和2A Peptides
2022-03-07 本文已影响0人
期待未来
-
单顺反子（monocistron）:真核基因转录产物为单顺反子，即一个基因编码一条多肽链或RNA链，每个基因转录有各自的调节元件。
-
多顺反子（polycistronicmRNA）在原核细胞中，通常是几种不同的mRNA连在一起，相互之间由一段短的不编码蛋白质的间隔序列所隔开，这种mRNA叫多顺反子mRNA。一个顺反子就是一个基因，多顺反子就是多个基因。双顺反子即两个顺反子。
-
常见的多顺反子包括IRES（Internal Ribosome Entry Site）和2A Peptides（P2A, T2A,E2A or F2A）IRES 和2A隔在两个基因中间，分别形成两个单独的转录本，分别翻译成蛋白质
internal ribosome entry site（IRES）
2A self-cleaving peptides
| IRES | P2A | |
|---|---|---|
| 定义 | IRES内部核糖体进入位点序列：是一段约500bp的核酸序列，这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，能独立的起始蛋白翻译。 | P2A肽(2A peptide)是一种可"自我剪切"的短小肽链，最初在FMDV中发现，约22个氨基酸，2A肽可在蛋白翻译时通过核糖体跳跃从自身最后2个氨基酸C末端断裂。 |
| 优点 | IRES优于2A肽的关键优势在于它不影响上下游ORF的蛋白序列 | 2A肽优于IRES的关键优势在于下游ORF的表达水平与上游ORF相当（或者略小于） |
| 缺点 | IRES的主要缺点是与上游ORF相比，下游ORF的表达水平比较低（通常为上游的10%-20%）。这就是为什么当人们在IRES后表达荧光蛋白时，常常难以获得可检测的荧光信号，特别是在体内应用。此外，IRES元件的大小（>500 bp）也可能会增加载体构建和病毒包装的难度。 | 2A肽的缺点可能是会在上下游ORF留下附加残基，从而可能产生不良影响。2A肽的自我切割并不是100％有效的，其效率会受上下游ORF序列的影响。因此，不能进行有效自我切割的融合蛋白将会是一种翻译产物，在某些实验运用中，这是一个值得注意的问题。 |
| 选择 | 如果实验不需要第二个ORF的高水平表达（如药物筛选标记），那么IRES应该是可以满足实验要求的。 | 然而，如果多顺反子中存在两个以上的ORF，或者等量共表达多个ORF很重要，我们建议您使用2A肽。 |
核糖体进入位点internal ribosome entry site（IRES）
- 本质：是一段核酸序列
- 意义：它的存在能够使蛋白质翻译起始不依赖于5‘帽结构，从而使直接从信使RNA（mRNA）中间起始翻译成为可能。
- 应用：IRES常用构建于真核生物双顺反子（bicistronic mRNA）中间，如此一来，第一个蛋白通常靠5’帽子结构起始翻译，而第二个蛋白则依靠IRES起始翻译。IRES前后的两个蛋白的表达通常是成比例的，因此可以根据其中一个报告基因的表达情况来反映另外一个蛋白的表达情况。
2A肽（2A self-cleaving peptides）
- 定义：是一类长18-22个氨基酸残基的肽片段，能诱导细胞内含有2A肽的重组蛋白自我剪切。这种肽都有一段的序列模体，经常会在最后甘氨酸（G）和脯氨酸（P）连接处导致核糖体无法连接，从而造成“剪切”的效果。
- 序列：下表罗列了四种2A肽的序列。虽然对2A肽的功能而言不是必要条件，在2A肽序列的N端加上一个GSG（Gly-Ser-Gly，甘氨酸、丝氨酸、甘氨酸）序列能提高2A肽诱导剪切的效率。
- 在四种常用的2A肽（P2A，T2A，E2A和F2A）中，P2A通常具有最高的切割效率（在某些情况下接近100％），接下来是T2A，其次是E2A和F2A。F2A的切割效率仅为约50％，我们通常推荐在多顺反子中使用P2A或T2A。
- “剪切”原理：在C端编码一个高度保守的共有基序（Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-//-Pro）剪切位点位于Gly-//-Pro之间。剪切的原理是2A的高级结构对核糖体肽基转移酶中心造成空间排阻，阻止Gly和Pro之间形成肽键，但是核糖体依然可以继续下游的翻译，整个过程不需要其他蛋白酶的参与。
| 种类 | 源于何种病毒 | 序列 |
|---|---|---|
| T2A | 明脉扁刺蛾病毒（Thosea asigna virus） | (GSG) EGRGSLLTCGDVEENPGP |
| P2A | 猪捷申病毒（Porcine teschovirus） | (GSG) ATNFSLLKQAGDVEENPGP |
| E2A | 马甲型鼻炎病毒（Equine rhinitis A virus） | (GSG) QCTNYALLKLAGDVESNPGP |
| F2A | 手足口病毒（Foot-and-mouth disease virus） | (GSG) VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP |
