原位杂交

Zebrafish RNA fluorescent in situ hybridization

前言：

学术定义：原位杂交是基于DNA或RNA反义序列会与互补的RNA序列发生氢键作用。通过对 "反义 "探针进行适当的标记，其结合的对应的mRNA可以被观察到。顾名思义，原位杂交允许人们在适当固定的细胞和组织内分析mRNA的空间分布（即在原位），从而提供一个关于基因转录位置和这些转录物随后如何处理的二维或三维视图。

历史发展：原位杂交最早于1969年引入，用于研究细胞水平的基因表达（Buongiorno-Nardelli & Amaldi, 1970；John, Birnstiel, & Jones, 1969）。后来，它被适应于组织切片，最后，在更好的固定和溶解技术的帮助下，它被适应于完整的组织和胚胎（Levsky & Singer, 2003回顾）。

传统的RNA FISH，直接在oligos 上标记荧光染料，根据碱基互补配对原则，与待检测的RNA 特异结合，通过荧光显微镜检测荧光信号，该方法一般需要20个oligos 以上，以便检测到较强较多的荧光信号点。在我之前写的miRNA 荧光原位杂交技术（FISH），就是采用的荧光标记探针法。除了其毋庸置疑的优势外，这些探针价格昂贵，并可能产生强烈的背景信号，导致低含量miRNA的信噪比低。

The first fluorescence in situ hybridization (FISH) approach was conducted in the early 1980s using an antisense RNA probe labeled with a fluorescent molecule covalently attached to its 3' end (Bauman, Wiegant, Borst, & van Duijn,1980).

However, this approach lacked sensitivity.

Better sensitivity was achieved by incorporating hapten-modified nucleotides (e.g., biotin-UTP) into the probes, which could then be detected using appropriate antibodies. Further sensitivity was achieved by incorporating secondary antibodies and additional enzymatic amplification steps.**

OVERVIEW AND PRINCIPLES

探针设计:

1.探针序列
对于标记的mRNA，我习惯的做法是通过本地BLAST，将mRNA比对至基因组，选后选择没有相似区域的片段，随机选一个片段（综合考虑TM值，碱基组成，长度等），取mRNA的互补序列（T转为U）。为保证特异性，将设计好的探针再次BLAST比对。
对于miRNA，没有选择余地。同样将其BLAST以了解其潜在的特异性。
2.探针长度
探针的长度对于最佳的成功也是至关重要的。最佳的探针长度在350到1000个碱基对（bp）之间。较长的探针会降低组织渗透性，增加非特异性结合，并减少未结合探针的清除。较短的探针会减少信号和增加非目标结合。
3.荧光选择
当检测多个mRNA时，就要考虑多种荧光的搭配使用。必须对熟练掌握各种标记的特性，荧光的光谱等，需要一定的知识储备。

miRNA： miRNA_biotin + Alexa Fluor™ 488 fluorescent streptavidin conjugates
mRNA, mRNA_Digoxin + Alexa Fluor 680-IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin

4.探针修饰
一个忽视的问题就是，探针RNA如不加修饰，其稳定性低。

Unmodified DNA and RNA probes have relatively poor binding affinity to target sequences [54], and therefore several modifications have been proposed to improve their properties。

已开发的修饰的类型有：

Locked Nucleic Acid (LNA) ：锁核酸修饰，应用最广；
2′fluoro-modified RNA (2′F RNA)
morpholino：吗啉代
Zip Nucleic Acids (ZNA)：
N,N-diethyl-4-(4-nitronaphthalen-1-ylazo)-phenylamine(ZEN)
2′O-Methyl (2′OMe) RNA：2′O-甲基（2′OMe）RNA修饰

可以参考生物公司关于修饰引物的介绍板块，如金斯瑞生物
其中，荧光修饰属于“荧光选择”部分需要考虑的问题。

下图总结了文献中应用各种探针的比例：

image.png

生物素标记分为三类： Biotin、Biotin TEG、Dual Biotin
biotin-teg中teg是三甘醇的缩写，在生物素中连接teg后可以延长生物素和核苷酸之间的距离，减少生物素和亲和素结合时的位阻。因此，使用biotin-teg的效果要好于biotin。

A dual biotin with two biotin molecules in sequence can increase binding strength with streptavidin. This helps to keep biotinylated DNA/primers on the beads during heating at higher temperatures, something that is a challenge for many customers. It has been seen that dual biotin prevents or effectively reduces leakage of biotinylated DNA from beads during heating (9).

image.png

信号放大:

1. 酪酰胺信号放大(Tyramide signal amplification)：
TSA原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的生物素沉积，与随后加入的Streptavidin—HRP/荧光基团结合，经几次这样的循环放大，可以结合大量的酶分子or荧光基团，结果使其检测信号得到几何级放大。

image.png
简单来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。

该部分视频学习资料：TSA在免疫组化和荧光原位杂交中的应用

2. 链霉亲和素偶联物
链霉亲和素蛋白是一类四聚体蛋白，大小为66kDa，每一分子SA 能够与四分子生物素Biotin进行高度特异性的结合，且两者之间的亲和力较强。应用该原理，将染料Cy3 偶联到SA 蛋白上，一分子SA 能偶联上6 个Cy3；同时在探针上标记生物素，将两者在体外进行亲和连接，大约每个SA 能与4 条Biotin-probe 结合，每个SA 上有6 个Cy3，也就是每一条探针上连接了6 个Cy3，因此该方法具有一定的放大信号的作用 。

Some of the simplest fluorescent detection schemes involving streptavidin entail
applying a biotinylated probe to the desired sample and then detecting the bound probe with a fluorescently labeled streptavidin. Fluorescent conjugates of streptavidin are commonly used to localize antigens in cells and tissues 4,5 and to detect biomolecules in immunoassays and DNA hybridization techniques.

SA-Biotin 系统

推荐产品：
Alexa Fluor™ 488 链霉亲和素
Alexa Fluor™ 488 链霉素亲和素偶联物的最大激发/发射波长分别为 ∼ (495/519)

值得注意的是，天然生成的生物素可干扰生物素-链霉亲和素检测方案。对于涉及固定或通透化细胞的实验，可使用内源性生物素封闭试剂盒最大限度减少这种干扰。

染色成像:

参考文献：

1. Urbanek MO, Nawrocka AU, Krzyzosiak WJ. Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods. Int J Mol Sci. 2015 Jun 10;16(6):13259-86. doi: 10.3390/ijms160613259. PMID: 26068454; PMCID: PMC4490494.
2. Wilk, R., et al. (2017). "In Situ Hybridization: Fruit Fly Embryos and Tissues." Current Protocols Essential Laboratory Techniques 15(1).
   3.LNA（Locked Nucleic Acid）碱基修饰技术