逆转录cDNA的合成----mRNA→cDNA
2020-03-27 本文已影响0人
Han_zh
一、逆转录PCR的原理（reverse transcription PCR,RT-PCR）
提取组织细胞总RNA，以其中的mRNA为模板，采用特异性引物、olig-dT或随机引物，在逆转录酶（reverse transcriptase）的作用下反转录成cDNA。再以cDNA作为模板，通过特异性引物，PCR扩增目的基因。
以mRNA为模板合成cDNA的过程，称为逆转录或反转录，所有合成cDNA第一链的方法都要依赖于RNA的DNA聚合酶即逆转录酶来催化反应。逆转录合成cDNA依赖于高质量的RNA，高质量的RNA应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂。
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二、mRNA逆转录成cDNA的实验（TaKaRa RR047A试剂盒）
※ 需要提前准备的东西：
- PCR管、1.5mL无酶离心管、黄白枪头、移液枪、酒精喷壶、口罩手套、PCR仪、
- cDNA保存于-20℃冰箱
三、mRNA逆转录成cDNA的操作步骤
A.去除基因组DNA反应
Kit 中使用了具有较强DNA分解活性的gDNA Eraser，通过42℃，2min即可除去基因组DNA。
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B.反转录反应（TB Green qPCR法）
mRNA → cDNA
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