RNASeq助力发现协调上皮器官发生和组织稳态的交互机制

期刊：Cell Reports

影响因子：9.423

近期，派森诺与中国科学院分子细胞科学卓越创新中心合作，在Cell Reports上发表了题为《Endothelial Wnts control mammary epithelial patterning via fibroblast signaling》的研究结果。该研究突出了内皮生态位在组织模式中的重要性，揭示了不同生态位组分协调上皮器官发生和组织稳态的交互机制。

研究背景

器官发生和组织稳态是由生态位中各种细胞类型的合作密切调控的，上皮细胞受到微环境中存在的一系列信号的影响，包括来自成纤维细胞和内皮细胞(ECs)的信号。许多哺乳动物的器官都经历分支形态发生，为特殊的器官功能创造一个很大的内部或外部表面积。乳腺是一种上皮器官，具有树形的导管网络。细长的基底细胞和立方腔细胞是乳腺上皮细胞的两个主要细胞系，Wnt/β-catenin信号通路对于乳腺的规范和形态发生以及MaSCs的特性至关重要。

在本研究中，我们构建了一种新的荧光Wnt报告小鼠，Axin2-membrane GFP (mGFP)，以促进在体内和体外研究Wnt反应细胞。我们通过体外共培养上皮细胞和成纤维细胞建立了一个新的乳腺类器官系统，使细胞类型特异性基因操作成为可能。以这种方式产生的类器官再现了乳腺分支形态发生，允许在上皮细胞模式中异型细胞类型之间的信号通信分离。结合体内和体外方法，我们首次提供了EC介导的成纤维细胞中Wnt信号的激活，从而调节乳腺上皮模式的证据。

研究思路

研究成果

1. 在乳腺的成纤维细胞中，Axin2-mGFP的表达是稳定的，与发情周期无关。

我们检测了mGFP在不同发育阶段的表达。在青春期乳腺中，Wnt信号在终端端芽(TEBs)中特别活跃。同样，我们在TEB区观察到mGFP的稳健表达，在基底细胞(腔细胞的一个子集)和周围的成纤维细胞中也有mGFP的表达。在青春期导管中，mGFP仅在基底细胞和成纤维细胞中表达，而在管腔细胞中则不表达。我们进一步分析了在发情周期成人乳腺中Axin2-mGFP的表达。我们发现，基底细胞中的Axin2-mGFP水平在发情周期中振荡，在发情期最高，这与之前使用Axin2-LacZ报告者的报道一致。成纤维细胞中Axin2-mGFP的表达不受发情周期的影响，四个阶段的荧光强度相似。

我们使用Axin2-lacz小鼠重复X-gal染色实验，证实了在发情时Axin2在基底细胞和成纤维细胞中的表达。此后，我们使用Axin2-mGFP报告来调查这种成纤维细胞非活性上皮细胞模式的影响，并确定有效Wnt配体的来源。

2. 乳腺分支需要上皮细胞和成纤维细胞

为了研究乳腺分支与上皮细胞和成纤维细胞的关系，我们做了一系列的相关实验。研究结果表明，这种具有三个异型细胞的共培养系统可以在体内重现乳腺上皮的结构。这种离体系统使得在单个细胞谱系（即成纤维细胞或内皮细胞）中进行基因操作成为可能，以研究它们在乳腺上皮模式中的非自主效应。

3.RNASeq分析

为了从分子上深入了解成纤维细胞Wnt信号如何影响乳腺上皮细胞，我们培养两个成纤维细胞比较组，区别为是否存在Wnt3a，然后进行RNA-seq分析。差异表达基因的富集分析显示，Wnt上调的基因在Wnt信号通路、细胞粘附、细胞增殖、ECM组织等通路中显著富集。qPCR分析证实，添加Wnt3a可上调Wnt靶(Axin2)、生长因子(Bmp2和Wnt2/5a)和ECM组分(Postn、Mmp10和Mmp15)的表达，剔除β-catenin则抑制Wnt3a诱导的基因表达。

使用从pdgfr–creer、β-cateninmice中分离的成纤维细胞在体内验证了这些变化。结果证实，在β-cat-KO体内成纤维细胞中，Axin2、Bmp2、Wnt2/5a、Postn、Mmp10、Mmp15也下调。这些观察结果与已知的成纤维细胞在上皮旁分泌信号通路和细胞外基质重塑中的作用一致。

4. 成纤维细胞Wnt信号是由ECs诱导的

为了确定与成纤维细胞信号传导有关的Wnt配体来源，我们分离了Axin2-mGFP小鼠的成纤维细胞，单独或与基底上皮细胞和/或从Actin-dsRed小鼠中分离的ECs一起培养。我们发现，与上皮细胞共培养，而不是基底上皮细胞，可以诱导成纤维细胞中mGFP的表达。单独与上皮细胞共培养相比，与基底上皮细胞和上皮细胞共培养对成纤维细胞mGFP表达的影响相似。这些结果表明，成纤维细胞Axin2mGFP的表达是由EC源性Wnt信号诱导的。

5. 内皮Wnts对成纤维细胞信号传导和乳腺分支至关重要

Wntless (Wls)编码Wnt特异性转运蛋白分子，这是Wnt蛋白正常分泌所必需的。为了研究EC来源的Wnts是否在乳腺分支中起重要作用，我们构建了Wls-cKO小鼠来阻断EC中Wnt的分泌。研究结果显示，无论是单独的成纤维细胞，还是与上皮细胞共培养，都不能激活成纤维细胞中Axin2-mGFP的表达，而与细胞共培养的成纤维细胞可以激活其表达。这表明EC源性Wnts占主导地位。总的来说，体外和体内的数据表明，EC来源的Wnts是激活成纤维细胞中Wnt/β-catenin信号的主要Wnt来源。

总结

我们在这里提供了第一个成纤维细胞如何将Wnt信号从内皮细胞传递到上皮细胞的例子。它可能对由内皮细胞和间充质细胞生态位组成的器官有广泛的意义。本研究的技术进展，即新的Axin2报告基因的产生和新的乳腺类器官系统的建立，对研究Wnt/b-catenin信号通路和器官发生具有普遍意义。

本文的转录组测序和分析由上海派森诺生物科技有限公司完成。