10x VDJ web summary troubleshoot

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使用Cellranger vdj 流程能得到一个网页版的报告，如上图样式.

今天将对这几个指标进行解释说明,用于后续troubleshooting。

问题：在10X V(D)J 数据中使用哪些指标来troubleshooting?

V(D)J网页报告提供了一些关键的指标，能够帮助排除V(D)J实验中的某些问题，由于GEX和V(D)J数据集之间的细胞富集差而产生。可以帮助解决这类问题。

指标1 ：Estimated number of cells

描述和限制：

细胞数量，barcode的数量估计与表达靶向V(D)J转录本的细胞有关。这个值取决于预期的T/B细胞数量。

失败的原因：

V(D)J细胞数量低于或高于预期可能是由于样本质量差、文库质量差或测序质量差。

• 如果细胞数量过高，建议cellranger multi删除背景*。

• 如果细胞数量过低，考虑查看Reads mapped to any V(D)J gene的值(如下)，并联系10x Genomics技术支持，获得文库富集溯源。

指标2 ：Reads mapped to any V(D)J gene

描述和限制：

部分或全部read比对到V(D)J基因片段的比例。

• Ideal > 50% ; > 40% is an acceptable limit.

失败的原因：

这可能与样本中B细胞或T细胞的比例有关。低比例的样本可能只有有限数量的B细胞或T细胞。这些样品可能需要富集，请参考这篇文章中的方法。

• 在一些其他的情况下，这可能是由于化学试剂用错或reference使用错误。

指标3 ：Cells with productive V(D)J spanning pair

描述和限制：

被称为是细胞的barcode的比例，每个受体对至少有一个链是productive contig（参考引申问题）。

• Ideal > 30% ; >20% is an acceptable limit

【引申问题】什么是productive contig呢？

使用cellranger vdj在contig_annotations.csv（或者filtered_contig_annotations.csv）结果中会有一列：Productive，

一个 productive contig必须满足下列条件：

1. 是跨过了V到J的区域，起始密码子在leader region。

2. 是否有一个带有起始密码子的可检测的CDR3区域

3. 在V-J跨越区域中没有停止密码子。

失败的原因：

较低的值可能表明样品质量较差，富集较差或低，覆盖较差或测序深度较低。捕获或表达单链可能有如下几个原因（参考引申问题）。

• 在极少数情况下，也有可能是化学试剂用错导致值低。

【引申问题】：为什么有些clonotype只有1个productive 链呢？

每个细胞都有一个TRA和TRB链，为什么有些clonotype只有1个productive 链呢？回答：Cell Ranger 流程没有过滤掉只有1条链的contig。有很多原因：

• 没有检测到mRNA转录本: 缺失链的mRNA转录本可能已经存在于细胞中，但没有被检测到。对于低表达的转录本尤其如此。

• 没有contig组装: 一些被检测到的转录本可能无法组装成contig。

• 未被标记为有效: 一些组装的contigs可能无法被标记为有效contig。过滤后的结果中只显示productive链。在all_contig_annotations.csv文件中能查找未被标记为有效的contig。

• 在极少数情况下，细胞可能只表达一条链。

指标4 ：Median UMIs per cell for V(D)J gene

描述和限制：

每个细胞中分配给VDJ 基因{每条链}的contig的UMI数的中位数(链是指TRA/TRB或IGH/IGK/IGL)。

• Ideal >0 UMIs

失败的原因：

中位数越高，表明对该链表达的支持越高。

中位数为0的UMI往往表明TCR/BCR链表达较差，样品质量较差，或在某些情况下富集较差/低。在极少数情况下，缺失的链可能反映了样本的生物学特性。

尽管表达水平与细胞类型有关，但通常情况下TRA转录本的表达水平要低于TRB转录本。如果有GEX数据，可以使用Loupe文件来识别T/B细胞的表达，步骤参考这里。

指标5：Barcode Rank plot

描述和限制：

根据实验，评估观察到的barcode被称为细胞的比例和每个条形码的UMI计数范围。

Y轴是UMI 数，是在x轴上映射到每个barcode的过滤过的UMI数。图的颜色基于与细胞相关的barcode的局部密度。

失败的原因：

在rank plot中出现的凸起可以表明一组高表达的细胞类型。例如，在Ig数据的web_summary中，浆细胞可以导致这种表型。

在下面的另一个例子中，V(D)J库中的细胞太少了，我们可以看到蓝色的线尾随到UMI很低的barcode中。

指标6：Valid Barcodes

描述和限制：

barcode校正后与白名单匹配的reads的比例。

• Ideal > 85%

• Acceptable is >75%

失败的原因：

如果这项出现有效barcode低的警告，可能发生以下几种原因:

• 通常与样品质量差、测序质量差或测序参数不当有关。

• 在极少数情况下，这一警告可能是由于SPRI清洗过程中乙醇洗涤液去除不完全，可能导致不需要的产品放大，有时会导致有效barcode降低。请参考这篇文章。

指标7：Top clonotype histogram

描述和限制：

histogram显示了样本中10个丰度最高的克隆型所占的细胞比例。在好的样本中，大多数克隆型会同时拥有两条链。

失败的原因：

如果注意到一个多链的大克隆型部分，这是极有可能是ambient RNA（*下文解释）。Cell Ranger v5及以上版本实现了一种更好的克隆类型分组算法。在多个克隆型中存在相同的链也表示为 ambient RNA。

*其他注意事项:10X的算法试图过滤掉含有ambient RNA的乳细胞受到压力或有一些链泄漏的barcode。如果有GEX文库，这可以从高表达的核糖体(RPS/RPL)、线粒体(MT-/)和MALAT1基因(死亡和死亡细胞的关键特征)中确定。如果适用，请参阅关于死细胞去除方案的技术说明。