【肿瘤二代测序-长期更新】肿瘤二代测序基础知识

Q1. 肿瘤FFPE样本靶药基因检测（NGS方法）中，为什么不采用唾液做对照呢？

A：肿瘤FFPE样本基因检测中，多采用白细胞做对照。之所以不使用唾液对照，是因为唾液中容易有细菌污染，当细菌跟人基因组同源性较高时，会损失一部分数据量，也会对变异检测造成干扰；再者，唾液的核酸提取率偏低，实验上比白细胞风险高些；综上，在临床中FFPE的对照多采用白细胞。

Q2：什么是PARP抑制剂?

PARP是一个家族，PARP抑制剂是一种靶向聚ADP核糖聚合酶（Poly ADP-ribose Polymerase）的癌症疗法。

简单来说，肿瘤细胞的核酸受到损伤后有两条路来进行修复，一条是PARP基因的修复，如PARP1，PARP1会结合在DNA损伤位点（多为DNA断裂位点）上，通过与催化位点结合产生一系列反应，继而募集到DNA修复蛋白进行DNA修复；第二条是通过HRR通路（Homologous Recombination Repair，HRR，同源重组修复）来修复错误。

PARP抑制剂通过与PARP1/2催化位点结合，导致PARP蛋白无法从DNA损伤位点脱落，被束缚在DNA上的PARP蛋白会导致DNA复制停滞和复制无法执行。此时，一般情况下，细胞会激活HRR通路来进行修复，但是当HRR通路发生缺陷时，DNA的修复功能就发生异常，从而导致细胞死亡。这也是PARP抑制剂的工作原理。

BRCA1、BRCA2蛋白在HRR通路中起到重要作用，所以在HRR的检测中BRCA1/2是极其极其重要的基因。有研究数据显示，携带BRCA1/2突变的肿瘤细胞对PARP抑制剂的敏感性是野生型的1000倍。

参考：https://www.shsmu.edu.cn/lib/info/1063/2109.htm，https://zhuanlan.zhihu.com/p/231471393；

Q3：什么是原癌基因？

A：人类基因组约有3万多基因，部分基因跟肿瘤的预防、发生、发展起着重要作用。对于已有研究的一些跟肿瘤相关的基因，人们将它们分成两类：原癌基因和抑癌基因。

原癌基因（Oncogene），原癌基因的蛋白质产物能刺激或者提高细胞的分裂增殖和生存能力，也包括那些能抑制细胞死亡从而在肿瘤生长中起到作用的基因。一般情况下，原癌基因是没有被激活的，只有当正常结合某些小分子的时候才被激活，而当原癌基因发生突变时，原癌基因一直被激活，由此引发肿瘤细胞的快速分裂增殖。

常见的原癌基因有ERBB2、KRAS、NRAS、HRAS、MYC、EGFR、BCL2等；

Q4：什么是抑癌基因？

A：抑癌基因（Suppressor）的蛋白质产物能直接或者间接地阻止细胞分裂或者导致细胞死亡。常见的抑癌基因有TP53、PTEN、APC和Rb基因等等。当抑癌基因发生突变，就极有可能改变蛋白产物从而使抑癌基因丧失抑癌功能。所以，抑癌基因往往没有热点。

Q5：PCR的过程？

A：PCR过程分为3个阶段：变性（Denaturation）、退火（Annealing）、延长（Extension）。

第一阶段 - 变性（Denaturation），该阶段体系温度升至95℃，几秒钟后，双链DNA中氢键断裂，形成两条单链DNA；

随后，PCR进入第二阶段---退火（Annealing），该阶段体系温度下降至50-65℃（具体依赖于引物的具体设计序列），引物退火或者粘附至单链DNA模板上；引物一般成对出现，Forward引物和Reverse引物，Forward引物结合在原模板序列的首端，Reverse引物结合在原模板序列的末端；为了防止DNA模板重新结合在一起，反应体系中会放入大量引物；该阶段时间一般为5-30s；

最后，PCR进入第三阶段 --- 延伸（Extension），该阶段体系温度将上升至72℃，DNA链在Taq DNA聚合酶的作用下，不断沿着5'->3'方向延伸，根据模板链的长短可以适当调整延伸时间；Taq 酶最初被发现于生活在美国黄石国家公园温泉中的嗜热细菌中，该酶在经过多轮的冷却和加热后依然能保持稳定。