外泌体的电镜观察

A 目的

直接观察外泌体

B 适用范围

全标本包埋外泌体

C 材料与方法¹

材料和仪器

100,000 × g exosome沉淀 或 富集的冰冻外泌体
2% or 4% (w/v) PFA
PBS
1% 戊二醛
草酸双氧铀, pH 7
甲基纤维素-UA, pH 4: 9份2% 甲基纤维素 +1份4%乙酸双氧铀，用前混合
Formvar-carbon载样铜网
封口膜
5号镊子
玻璃培养皿
不锈钢环，比铜网略大
1号滤纸
铜网储存盒
透射电镜

方法

将exosome固定在载样铜网上######

1. 重悬100,000 × g离心的exosome沉淀到50-100 μl 2% PFA
   如果是富集的冰冻exosome，融化并与等量 4%PFA混合
   注：2% PFA中的exosome可在4℃储存一周
2. 将5 μl exosome悬液加到Formvar-carbon载样铜网上。每份exosome样品准备2-3个铜网。盖上盖子，在干燥环境中让 Formvar膜吸收20min
   *注：也可将5到10 μl exosome悬液滴加到封口膜上，将铜网Formvar膜面朝下放在悬液上
3. 将100μl PBS加到封口膜上。用镊子将铜网 (Formvar膜面朝下) 放在PBS液滴上清洗
   重要:在所有步骤中，都应保持Formvar膜面湿润，而另一面干燥.
   注：相同样品的铜网可在同一PBS液滴中清洗
4. 将铜网放在 50μl 1% 戊二醛液滴上 5 min.
5. 将铜网放在 100μl ddH₂O 2 min（洗8次）

反差增强及包埋样本######

6. 将铜网放在50μl草酸双氧铀液滴上 pH 7, 5 min
7. 将铜网放在50甲基纤维素-UA液滴上 10 min，冰上操作
8. 用不锈钢环移开铜网，在滤纸上轻轻吸去多余液体，留下一薄层甲基纤维素膜
   应将甲基纤维素膜的厚度控制在适当范围，这会影响到影像的对比度。不锈钢环被固定在1ml蓝枪头上
9. 铜网仍在不锈钢环上，空气中干燥5到10 min
   干燥后, 蓝-金色的干涉条纹说明甲基纤维素膜厚度合适、均匀
10. 将铜网处在在盒子里
11. 80 kV下拍摄电镜照片.
    *注：电镜下，负染exosome显示为50-90 nm杯状膜泡。10-20 nm的脂质颗粒也常会被观察到。exosomes的形态可能被样品制备过程所影响。未发表的论文观察到冷冻电镜下exosome的形态较圆

Figure 1. TEM下exosome形态。箭头示exosome，三角形示脂质颗粒

Ref:
1: Current Protocols in Cell Biology