【文献分享】单细胞水平下光信号对拟南芥细胞命运决定的调控机制

光是植物生长发育最重要的调控因子，不仅为植物提供能源，还作为信号因子调控植物发育的整个生活史。其中，光、暗条件下幼苗的形态建成是光信号调控植物发育最显著的表现形式：暗中生长的黄化苗具有长下胚轴，顶端弯钩和闭合的子叶；黄化苗见光后，下胚轴停止伸长，顶端弯钩打开，子叶开展变绿。光信号通过同时控制不同器官的发育快速转变为光形态建成，以更好得进行光合作用。因此，幼苗去黄化过程不仅作为研究光信号调控的模式，也是多种细胞发育过程的综合体现。

今天分享一个，最近发在nature plants上的文章，这个paper是北京大学现代农业研究院邓兴旺院士团队的，题目是Time Series Single-Cell Transcriptional Atlases Reveal Cell Fate Differentiation Driven by Light in Arabidopsis Seedlings，这个paper首次获得了植物单细胞水平暗转光过程中基因的表达动态，解析了光信号调控网络在表皮、维管、皮层等多种细胞发育过程中的作用方式。

==========实验设计==========

该研究通过分别对持续黑暗生长5天、暗转光1小时、6小时、24小时以及持续光照生长5天处理的拟南芥幼苗地上、地下部分进行单细胞转录组测序。

=========实验结果===========

1. 去黄化幼苗细胞单图谱的构建

单细胞测序后，shoot获得了31,796个cell，root获得了61,065个cell。root聚类完获得了28个cluster（图1a），shoot聚类完获得了33个cluster（图1b）。并用已知的marker进行了注释（图1c和1d）。

图1

通过不同时间点的对比发现，根细胞类型的状态是稳定的（图1e），但在去黄化期间，茎也就是地上部分细胞类型发生了广泛的变化（图1f）。叶肉细胞（Mes）、表皮细胞（E）和皮层细胞（C）的转录状态发生了渐进但根本性的变化，然而，维管束细胞簇（Vas）对光照相对不敏感。因此，作者在随后的分析中重点关注茎细胞类型。

图1

然后作者通过已知标记物和报告基因进行验证，从而获得了精细注释的高分辨率图谱（图2）。

图2

2. 时空标记的识别

然后作者尝试鉴定细胞类型特异响应的marker基因。作者总共鉴定了9,997个具有明显表达偏好的根细胞类型特异性基因和6,702个具有明显表达偏好的茎细胞类型特异性基因，其中包含一些一直的marker基因。例如一些transporters，例如SWEET11, SWEET3, NPF7.3等在维管束parenchymal cell中特异表达（图3a）。

为了从所有聚类特异性基因中分类光调节基因，作者首先处理了幼苗的子叶、下胚轴和根组织，在暗转光过渡期间进行了普通转录组测序。利用本研究和之前发表的解除休眠幼苗的器官特异性RNA-seq数据，作者鉴定了13,653个基因，它们与黑暗相比，在至少一个组织中的一个光照暴露时间点有显著差异表达。超过60%的光诱导差异表达基因（DEGs）（8,212/13,653）被鉴定为在细胞类型间有差异表达，并构成了在scRNA-seq数据中鉴定的DEGs的66.0%（8,212/12,447）。并且这些特异的marker大多数是受光照调控的（图3b）。

为了广泛解析基因空间时间表达模式，作者在五个不同时间点构建了七种茎细胞类型的共表达网络。利用WGCNA构建了73个modules。研究表明，ME1中的基因功能与光合作用相关。与光诱导的模块ME1相比，ME6和ME7中的基因在没有空间偏好的Dark样本中检测到更高的表达。光形态发生相关转录因子HY5/HYH和负转录因子PIF1和PIF5被归类为属于ME1。HY5的直接靶基因的近三分之一（80/295）在解除休眠过程中被分配到ME1。PIFs45,46（PIF1、PIF3、PIF4、PIF5）的靶基因富集于ME1（43/333）和ME6（30/333），其他靶基因则具有空间差异。总之，基本的光信号传导网络在不同的细胞类型中普遍诱导。然而，调节的基因倾向于以细胞类型偏好进行转录。

图3

3. 光平衡木质部和韧皮部的发育

因为维管束负责水以及营养元素的转运，在链接地上部分和地下部分之间起着关键的作用。因此，作者筛选了来自维管细胞簇（Vas1–Vas7）的9,088个细胞，并根据维管高变异基因重新进行了聚类（图4a）。例如，原先的cluster Vas1进一步细分成了Pr1和Pr2。在原始维管细胞簇中，DOFs和ERF114等在增殖细胞中表达的基因得到了积极转录（图4b）。

在黑暗条件下，Pr2占主导地位，而在光照1小时后，Pr1的比例增加。在照明1天后，Pr3构成了主要位置。此外，细胞分裂的比例在光辐射后增加。综上所述，原始维管细胞处于茎部维管系统中光感知和信号传导的中心（图4a）。

木质部和韧皮部在黑暗和光照的条件有都有所形成。维管束的轨迹分析结果表明有2个分化方向，一个是望韧皮部，一个是望木质部（图4c）。并且韧皮部在1h光照处理后细胞比例明显增加。为了全面研究特定于维管细胞的响应基因，作者利用上述WGCNA寄过筛选出了共表达网络中具有更高特征值的维管组基因模块。其中模块ME52含有119个基因，并且只在维管束细胞中被诱导（图4d）。其中作者阐述了几个转录因子，它们在韧皮部发育中可能具有重要而新颖的功能。

图4

4. 光通过轨迹转换促进气孔细胞的发育

与维管细胞不同，子叶表皮细胞亚型在由暗生长状态转变为亮生长状态的过程中经历了巨大的状态转变（图1f）。其中E.C.3类则是相对稳定的。作者将E.C3簇细胞注释为气孔细胞（GC）。研究表明，三个气孔谱系（SL）特异性碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子的顺序表达促进原表皮细胞（PDC）向成熟气孔细胞的发育。然而，所有轨迹都是在亮生长的幼苗表皮细胞中重建的。

为了解决暗和光引起的发育轨迹变化，作者首先重建了暗和光中SL细胞图谱（图5a-5d）。研究表明，发育方向从SL2开始，经过SL3最终发展成SL4和SL5，这与以往的研究一致。通过相同的管道，对于暗生长条件下的SL细胞绘制了不同的情景。尽管M细胞与SL2聚类并且靠近，但未出现在前体细胞和GC的交界位置。RNA速率推断的轨迹方向表明，在暗中GC是从前体细胞直接发育而来的，而不是通过M细胞状态。使用脱黑素样本的表皮细胞更清晰地描绘了通往GC的两个不同的发育轨迹。发育过程始于颜色较深的前体细胞，经过M细胞（SL3）或直接发育成GC（SL5）。值得注意的是，通往GC的直接路径仅在暗生长的幼苗样本中丰富。因此，作者推断表皮细胞可以在暗中发育为GC，但是通过完全不同的轨迹。这与报道的也是相吻合的，比如早期SL发育的marker基因，SPCH和BASL，主要在SL3中表达。

为了探索气孔细胞在黑暗和光照条件下的发育过程，将典型亮光轨迹和暗生长特异直接轨迹的细胞与其他细胞分开，并根据拟时序一步排序。在合并的表皮细胞图谱上标识了参与各自发育过程的候选因子。研究表明，图谱包括三条路径，即暗生长特异轨迹到气孔细胞、典型亮光轨迹到气孔细胞以及气孔前体细胞的脱黑过程（图5和5f）。候选调节因子在不同光照条件下对气孔细胞发育和成熟的关键作用需要进一步研究（图5g）。最后作者总结了一个气孔发育的模型（图5h）。

图5

5. PIFs的细胞类型特异性功能

PIF转录因子是参与光形态发生的核心负性转录因子之一。作者通过单细胞RNA测序技术对黑暗生长的PIFq和WT幼苗的茎组织进行了分析（图6a-b）。研究表明，与WT相比，表皮和叶肉细胞的比例增加，而导管、内皮和皮层细胞的比例减少。和前面dark的数据对比发现，cortex2只在WT和pifq的合并数据中出现（图6c-d）。

作者确定了PIFq和WT之间的差异表达基因。通过PIFs的突变体发现，基因表达抑制在生长素响应途径中富集，而表达激活广泛存在于光合作用基因中（图6f-6g）。

为了研究PIFs在细胞状态变化中的直接作用，作者在单细胞水平鉴定了PIFs靶基因的表达。超过四分之一(71/276)的PIF高表达直接靶基因在内胚层细胞中得到高转录，PIF诱导的表达下降突变在所有细胞类型中相似（图6h）。此外，MMCs和GCs特异性表达差异显著。因此，作者分析了PIFq和WT的表皮细胞的发育轨迹（图6i和6j）。PIFq样品中的气孔细胞系细胞在GC发育的成熟状态中富集（说实话从图中没太看出来）。鉴定了GC发育过程中的差异表达基因和PIF直接靶基因的表达模式（图6k）。这些靶标在GC发育和成熟的特定阶段被转录。此外，在PIFq突变体中，成熟阶段高度转录的靶标的表达诱导得到了增强。在黑暗条件下，PIFs促进胚乳生长素应答基因的表达，但抑制气孔系细胞的GC成熟因子，通过细胞类型特异性表达靶标实现独立调控。

图6 图6

6. 不同的芽细胞类型对光线的不同反应

然后作者又用了一个单独的章节从global的角度对比了一下各个细胞类型对于光照的响应。