12个样本+转录组标准分析=IF6.023——最新项目文章：BP

2022年5月20日，山西农业大学袁建琴老师在Food and Chemical Toxicology （IF=6.023）发表题为“Bisphenol a exposure decreases learning ability through the suppression of  mitochondrial oxidative phosphorylation in the hippocampus of male mice [1]”的研究论文，通过12个样本的转录组测序+标准分析+验证实验+基础实验，阐述了BPA诱导神经毒性的分子机制，发现BPA暴露通过抑制雄性小鼠海马中的线粒体氧化磷酸化降低学习能力。

摘要

双酚A (BPA)在环境中无处不在。许多研究表明，BPA会引发动物的中枢神经系统功能障碍，但BPA神经毒性的分子机制尚不清楚。因此，本研究旨在评估雄性小鼠海马体在BPA暴露（0 mg/L，对照组（C）；0.01 mg/L，低剂量（L）；0.1 mg/L，中剂量（M）和 1 mg/L，高剂量 (H)）下的神经毒性作用。通过互作网络分析和富集分析，筛选出九个与氧化磷酸化（OXPHOs）相关的差异表达基因（DEG）并定位。总体而言，BPA 暴露破坏了海马中的规则细胞排列，降低了学习能力和睾酮 (T)/雌二醇 (E2) 的比例，抑制了与OXPHOs相关的基因表达，尤其是降低了与学习能力和复合物I、III、IV和Ⅴ的活性，最终导致海马线粒体ATP合成异常，导致大脑（海马）心肌能量供应迅速萎缩。这些结果表明线粒体OXPHOs的破坏可能是BPA诱导小鼠学习能力下降的机制之一。总之，作者的研究结果为BPA诱导的神经毒性的分子改变和信号通路提供了创造性的理解和研究方向。

实验方法

实验材料：小鼠海马体（BPA暴露：0 mg/L，对照组（C）；0.01 mg/L，低剂量（L）；0.1 mg/L，中剂量（M）和 1 mg/L，高剂量 (H)）

测序方法：RNA-seq

测序平台：Illumina NovaSeq 6000；PE150

实验方法：动物行为实验（旷场试验，八臂迷宫试验）；组织学观察；RNA-seq；Elisa；qRT-PCR；WB

研究结果

01 小鼠行为变化

在旷场测试中，暴露于BPA的雄性后代小鼠显着减少了进入中心区域的时间和次数。在八臂迷宫中，服用BPA显着增加雄性小鼠的参考记忆错误和工作记忆错误。这些结果表明，BPA 可能对雄性后代小鼠的探索、空间学习和记忆产生损害影响。

图1 旷场试验和八臂迷宫试验

02 海马结构的组织形态学改变

HE染色用于判断暴露于BPA的雄性后代小鼠海马的神经元损伤效应。C组均呈规则而紧凑的细胞排列，H暴露组DG区神经元数量明显减少，M暴露组和H暴露组CA1区神经元数量明显减少，神经元排列不规则且稀疏。

图2 海马体组织学观察（齿状回（DG）、角质层1（CA1）和角质层3（CA3））

03 激素影响

与C组相比，在较高剂量BPA下显着降低了T浓度。M和H组小鼠的E2浓度显着提高。T/E2的比率呈剂量依赖性降低。不同浓度的BPA会干扰雄性后代小鼠的性类固醇激素分泌。这些发现表明，BPA可能通过改变性激素水平引起各种相关的异常或疾病。

图3 激素影响

04 RNA-seq差异表达分析

转录组测序结果显示，每组3个重复序列具有高度相似性；与C组相比，L组有3309个基因差异表达（1569个上调，1740个下调），M组有1796个基因（828个上调，968个下调）， H组中1055个基因（502个上调，553个下调）。

图4 RNA-seq差异表达分析

05 GO、KEGG富集分析

作者主要针对C组和H组之间的DEG进行GO和KEGG富集分析。在生物过程(BP)中富集最明显的是对病毒的防御反应。在细胞成分(CC)中富集最明显的是核糖体亚基。在分子功能（MF）中富集最明显的是核糖体的结构成分，还有 NADH 脱氢酶（泛醌和醌）活性、与物质运动耦合的 ATP 酶活性、和作用于醌和 NAD(P)H 的氧化还原酶活性等。

在 KEGG 富集分析中，最显著富集途径是阿尔茨海默病 (AD)、产热、核糖体、亨廷顿病 (HD)、OXPHOs、帕金森病 (PD) 等。与学习记忆相关的信号通路有AD（mmu05010）、PD（mmu05012）、HD（mmu05016）。三种途径（AD、PD和HD）的各种基因被交叉，其中16个基因重叠。

图5 GO和KEGG富集分析

06 OXPHOs差异基因分析

通过KEGG分析，OXPHOs相关DEG（mmu00190）的表达也明显富集，其中包括该途径中的23个基因。此外，与OXPHOs相关的DEG主要与参与AD、PD和HD通路的DEG重叠。这些发现表明，OXPHOs的变化可能涉及BPA引起的神经系统疾病共病的过程（即降低小鼠的学习和记忆能力）。

图6 OXPHOs差异基因分析

07 QRT-PCR验证

在动物海马组织中通过 QRT-PCR 筛选和验证了总共 9 个 DEG（Ndufa3、Ndufb10、Ndufs8、Uqcrh、Uqcrb、Cox6b1、Cox7b、Cox7c 和 ATP5G1）。BPA处理组海马认知能力相关神经障碍通路9个基因mRNA的相对表达均显着降低，与转录组测序结果一致。

图7 QRT-PCR

08 Ndufb10蛋白的表达水平

通过蛋白质印迹验证Ndufb10蛋白质表达。与C组相比，H组Ndufb10蛋白的表达水平显着降低，这与RNA-Seq和QRT-PCR分析一致。

图8 WB验证

09 BPA对四种配合物活性的影响

为了研究OXPHOs在BPA降低小鼠学习和记忆能力中的作用，评估了呼吸链中四种线粒体复合酶的活性。M组和H组中的BPA明显抑制了复合物-I（NADH-CoQ氧化还原酶）、复合物-III（CoQ-细胞色素c氧化还原酶）、复合物-IV（细胞色素c氧化酶）和复合物-Ⅴ（ATP酶/ATP合酶）的活性。

图9 四种复合酶的活性

研究结论

综上所述，在目前的体内动物模型中，BPA导致动物学习能力下降的机制很多，BPA引起的学习能力下降可能与线粒体OXPHOs相关基因的改变和海马体中的蛋白质水平有关。作者的研究结果为BPA诱导的神经毒性的分子改变和信号通路提供了创造性的理解和研究方向。

研究思路

本文亮点

本文作者将动物行为实验与分子层面的RNA-seq相结合，同时配合一系列验证实验，对BPA诱导神经毒性的分子机制进行探究，发现线粒体OXPHOs的破坏可能是BPA诱导小鼠学习能力下降的机制之一。