清华大学陶磊团队《Nature》子刊：Hantzsch反应高通量

背景

意外的核泄漏增加电离辐射的风险，NASA最近证实了在外太空停留340天的两个兄弟之一由于强烈的电离辐射导致其8–9％DNA发生永久突变。人类还没有为需数年甚至数十年的太空旅行做好放射防护准备。辐射防护器的研究已有60多年的历史了，如氨磷汀（一种硫代磷酸酯）是美军抗辐射药物开发计划所研究的，已取得了可观的成果。然而，氨磷汀迅速被人体排出，并具有严重的副作用（如低血压，发烧，恶心和呕吐），这极大地限制了其应用。因此迫切需要安全有效的放射防护剂来治疗或预防由高剂量的辐射引起的急性伤害。

最近，清华大学的陶磊团队以多组分反应（MCR）为基础制备具有辐射防护功能的聚合物。MCR功能强大，可以轻松以高通量的方式制备单体/聚合物库。这种方法可以克服开发安全有效的聚合物辐射防护剂的限制。作者报道了通过Hantzsch反应以高通量方式高收率合成了单体库，这些单体高通量共聚反应构建水溶性聚合物库。然后通过高通量测量筛选这些聚合物，实现具有最佳抗辐射能力的生物相容性聚合物。在细胞和体内实验中，这种选定的聚合物可有效保护细胞和斑马鱼胚胎免受致命剂量的电离辐射（80 Gy X射线）的伤害（图 1）。文章以“High-throughput preparation of radioprotective polymers via Hantzsch’s reaction for in vivo X-ray damage determination”为题发表在《Nature Communications》期刊。

图1：基于Hantzsch反应的抗辐射聚合物。

结果和讨论

通过Hantzsch反应和相关聚合物库的高通量制备单体库

通过高通量方式的Hantzsch反应，将商购获得的单体甲基丙烯酸2-（乙酰乙酰氧基）乙酯高效（88–98％）转化为含有不同的1，4-DHP部分的单体。使用九种醛的不同组合创建了45种Hantzsch单体（M(X)(Y)）（图2a）。通过1H NMR鉴定1,4-DHP环中乙烯基和次甲基的质子之间的积分比与理论值一致（图2b），表明可以通过高通量 Hantzsch反应轻松地制备不同的Hantzsch单体。通过自由基聚合将这些M(X)(Y)单体与聚（乙二醇）甲基醚甲基丙烯酸甲酯（PEGMA，M n：950 g/mol）共聚，以高通量方式获得水溶性共聚物(P(X)(Y))（图 2a）。PEG链末端的1,4-DHP次甲基和甲基之间的积分比与理论值非常匹配（图2c），表明在高通量自由基聚合后成功制备了所需的共聚物。

图2：Hantzsch单体和相关聚合物。a) 高通量制备45种的单体和45种的聚合物。b)单体的1H NMR谱。c) 聚合物的1 H NMR谱。

第一轮筛选：高通量测量P(X)(Y)的自由基清除能力

辐射防护剂通常来自自由基清除剂。羟基自由基（OH•，HOR）和超氧阴离子自由基（•O2-，SOR）是由水和氧气分别在细胞对电离辐射产生的典型的活性氧物种（ROS）。Galvinoxyl自由基（GOR）是一种抗氧化剂中常用的氧自由基。作者以高通量方式测量P(X)(Y)清除HOR，SOR和GOR的能力。聚合物的自由基清除能力取决于自由基的种类以及A(X)和B(Y)的组合,表明建立样本库以利用放射防护器的合理性和必要性。六种聚合物，即P(2)(1)，P(2)(3)，P(5)(4)，P(8)(1)，P(8)(2)和P(8)(4)（图 3，红色箭头）, 有效地清除85％以上的三个自由基，被选择用于下一个研究。

图3：聚合物的抗HOR，抗SOR和抗GOR能力。

第二轮筛选：选定聚合物的放射防护能力的细胞实验

电离辐射导致的ROS迅速产生可扩散的次级自由基，这些次级自由基攻击DNA并导致DNA断裂以及细胞和器官损伤。作者以鼠成纤维细胞系L929为模型细胞，以测试六种所选聚合物的辐射防护能力。使用荧光素双乙酸盐/碘化丙啶（FDA / PI）双重染色法以激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察活细胞和死细胞（图 5a）。在空白组和P（PEGMA）组中，几乎没有细胞在80 Gy X射线辐射下存活，表明高剂量的X射线对细胞具有致死性，P（PEGMA）几乎没有放射防护能力。所选的聚合物具有浓度依赖性的辐射防护能力。P(5)(4)对细胞没有保护作用。P(8)(1)存在时，很少有细胞能幸免于辐射。P(2)(3)，P(8)(2)和P(8)(4)在对细胞具有保护作用，结果表明使用Hantzsch反应来研究辐射防护聚合物的可行性。

图5：评估不同化合物的放射防护能力的细胞实验。

随后，作者研究了辐射防护机理。辐射引起的细胞中的ROS是一系列严重后果的直接原因。作者通过使用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针检测不同培养条件下细胞中的ROS水平。培养过程中，在正常细胞中几乎未检测到荧光，但是暴露于80Gy X射线辐射后，随着时间的推移，荧光明显并随时间增加。氨磷汀和P(2)(1)均可有效控制细胞中的ROS水平，表明氨磷汀和P(2)(1)的抗辐射能力与其清除细胞中辐射诱导的ROS的能力有关。此外，DNA是辐射损伤的主要目标，聚集性DNA损伤和碱基对的损伤是电离辐射的标志。作者进行单细胞凝胶电泳以检测在不同条件下的细胞损伤的DNA（图 5c）。与正常细胞相比，暴露于80 Gy X射线的细胞明显具有长尾巴（损坏的DNA），表明该X射线剂量很容易破坏细胞DNA。氨磷汀（0.3 mg / mL）部分保护DNA，导致尾巴更短。由于P(2)(1)中的1,4-DHP基团，能有效保护DNA免受高剂量X射线辐射的侵害，培养细胞的尾巴可忽略。这些结果与细胞中受损DNA的定量分析一致（图 5d）。P(2)(1)和氨磷汀都是有效的辐射防护剂，它们可以有效保护细胞DNA免受辐射损伤；与氨磷汀和其他聚合物相比，由于P(2)(1) 出色的细胞安全性，可大剂量使用，提供更好的细胞保护。因此，P(2)(1)选用于下一个体内研究。

斑马鱼胚胎对高剂量X射线的放射防护

斑马鱼的基因与人类的基因的相似性>85％。斑马鱼的胚胎很小、光学透明、胚胎发育短，有利于快速直接观察辐射引起的对动物的伤害（死亡，变形，器官异常和DNA受损）。因此，斑马鱼的胚胎被用来研究辐射诱发突变和评价防辐射剂。作者将60头斑马鱼胚胎（置于带有P(2)(1)玻璃培养皿中，并暴露于X射线辐射。用A啶橙（AO）染色以选择性地染色经历凋亡/坏死的细胞中的核酸。使用LSCM捕获胚胎的图像（图 6a），并分析荧光强度以测量具有坏死的细胞（图 6b）。正常胚胎（约60 hpf）发育出可识别的眼睛和尾巴。暴露于X射线的胚胎失去了这些器官，并显示出清晰可见的绿色荧光，表明由辐射诱导的胚胎死亡。用氨磷汀对斑马鱼胚胎的保护作用不足，培养的胚胎腹部肿胀。P(2)(1)存在时，胚胎具有无法分辨的AO荧光，胚胎发育类似于正常胚胎的眼睛和尾巴。超氧化物歧化酶（SOD，自由基清除剂），生成丙二醛（MDA中，脂质过氧化的最终产物）是辐射诱导的损伤的生物标记物。作者测量了胚胎中SOD和MDA的水平（图 6c）。P(2)(1)显著地改善异常指标。

图6：体内实验（斑马鱼胚胎）以测试不同化合物的放射防护能力。

斑马鱼胚胎的放射后遗症

通常情况下，斑马鱼的胚胎形成幼虫约120hpf。作者记录在不同条件下来自胚胎的幼虫的形态（图 7a）和数量（图 7b）。X射线对斑马鱼胚胎的发育造成相当大的损害，暴露于80 Gy X射线后，孵化率低（10％），且变形率高（100％）（图 7a，b）。用P(2)(1)培养的胚胎孵化率达80％，变形率为29％，表明P(2)(1)在可预防辐射。并且，通过观察抗体溶液表明P(2)(1)可充当抗辐射剂，有效地抵消了辐射引起的DNA损伤。

图7：在存在不同化合物的情况下斑马鱼胚胎的辐射后遗症。

结论

作者根据高通量策略构建了一个小的聚合物模型库，以选择简单的聚合物作为辐射防护剂。所开发的聚合物的保护作用优于常用的辐射防护剂——氨磷汀。该研究能促进聚合物科学中MCR和高通量方法的广泛研究，并提升跨学科应用的其他功能性聚合物的发展。尽管已发现酚和二茂铁取代基可改善聚合物的抗氧化能力，但尚未总结出规则可以更有效地指导聚合物抗辐射剂的未来发展。在未来的研究中，应准备更大的样品库，并应使用理论计算来总结从头设计具有更好抗辐射能力和生物安全性的聚合物的规则。

参考文献：

nature.com/articles/s41467-020-20027-0

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