转移性黑色素瘤的综合基因组分析（NGS panel + 机器学习

转移性黑色素瘤的综合基因组分析：来自7个意大利癌症中心的网络筛查结果

Comprehensive genomic profiling on metastatic Melanoma: results from a network screening from 7 Italian Cancer Centres. J Transl Med22, 29 (2024) (IF=8.448).

摘要

目前晚期黑色素瘤的治疗包括靶向和免疫治疗，主要是通过免疫检查点阻断。虽然实体瘤的综合基因组分析已被批准作为伴随诊断，但除了 BRAF V600E 突变和有争议的肿瘤突变负担外，仍然没有批准的黑色素瘤预测生物标志物。本研究从7个意大利癌症中心收集的82个接受靶向和免疫治疗的 III-IV 期黑色素瘤患者样本和匹配的血液通过定制的NGS panel 进行测序，通过Ion Reporter框架进行初步分析，进一步进行包括单变量和多变量、COX/Lasso 组合和随机森林机器学习建模分析。除了一些基因靶标外，ACC-mela 队列的基因组学景观在单核苷酸变体和 INDEL 的体细胞水平上具有可比性。所有临床相关靶标（例如 BRAF 和 NRAS）具有可比较的分布，因此表明大规模测序在黑色素瘤中的价值。由于生物技术偏差和队列数量，CNV 水平没有达到可比性。完全缓解的肿瘤突变负担中位数略高，但通过多种阈值策略在 Kaplan-Meier 生存分析中未能达到统计显着性。PDGFRB、NOTCH3 和RET 突变被证明对免疫检查点治疗的总生存期和无病生存期有积极影响，而NOTCH4 的变异被发现对这两个终点都是有害的。本研究的结果显示了基因组学驱动的网络试验的价值和挑战。这些数据也可以作为免疫疗法和靶向疗法基因组生物标志物研究的验证队列的宝贵资源。

流程图

数据及脚本

https://gitlab.com/bioinfo-ire-release/acc-melanoma

结果

1.BRAF 突变状态验证

目前IV 期黑色素瘤的治疗流程包括对 BRAF V600E 突变阳性患者进行靶向治疗，然后通过 PD1 和/或 CTLA4 抑制和化疗作为优先步骤进行免疫检查点阻断。本研究基于NGS方法检测到46/83例BRAF密码子600突变的患者。其中45/46患者被检测到为常规的BRAF突变，一个不一致的样本携带BRAF p.V600K，通过NGS方法鉴定，VAF为7%，进一步通过qPCR测定进行确认，其检测结果与NGS存在差异，排除该样本，最终保留82患者。

2.黑色素瘤患者基因组体细胞突变及CNV全面分析

ACC-mela的多中心队列包括82例III-IV期患，其中46例（56%）接受免疫检查点治疗，36例（44%）接受靶向BRAF/MEK抑制剂治疗。针对突变位点分析结果，ACC-meta队列基因组与更大人群比较时候，少数基因在ACC-mela的突变比例中过度表达，即MAPK1和DDR2（倍数变化分别为0.59和0.51）。这种不对称性可能是与全外显子组测序（从10%到20%VAF）相比，靶向测序（低至VAF的5%）的检测分辨率差异，以及ACC-mela队列的数量较少导致的。值得注意的是，BRAF和NRAS等临床相关靶点具有可比的发生率（BRAF为53-58%，NRAS为23-28%），因此表明在黑色素瘤背景下进行更大规模测序的价值。针对CNV分析结果，ACC-meta靶向捕获中分别有13.1%和4.3%的缺失和扩增的倍数变化变异>1，这种不平衡的结果是由于基于扩增子的CNV检出方法的强烈差异引起的。最后，为了评估了ACC-mela的每个患者中的药物可操作性变异，区分标准治疗的可操作性(levels A )和研究治疗(levels B/C)。通过OncoKB注释了所有体细胞突变和 CNV。考虑到代表整个数据集中重大事件的 BRAF突变，14.3% 的患者表现出高水平的可操作性状态（levels A级），13.7% 的患者携带可以通过推定的再利用（levels B-C级）靶向的变体。

3. 免疫检测点反应标记物预测

肿瘤突变负荷(TMB），定义为采样基因组中的体细胞变异量,被认为是一种有价值的生物标志物。本研究计算了TMB生物标记物在随着其最小变异等位基因频率、突变类型和 TMB 高/低阈值时改变时预测ICI反应者的准确性。将ACC-mela TMB分层功效与其他大型数据进行比较时，TMB在5%和15% VAF下未能达到统计学意义，但在5% VAF 过滤下，完全缓解者(CR)的 TMB 中位数高于进展性疾病。

本研究试图考虑单个突变对ICI治疗期间总生存期和无进展生存期的影响，所有基因组事件均通过突变状态对总生存期和无进展生存期影响的 COX 单/多变量模型进行排名，LASSO Cox回归用于变量选择和收缩。在获得了 100个合理的模型，并选择了与生存时间最显着相关的前 10个模型。对于总生存期和无进展生存期，NOTCH4 突变对 ICI 相关生存期有负面影响。在总生存期中，PGFRB、RET、NOTCH3、NOTCH1 和 BRAF 存在体细胞变异的患者预后较好。其他基因，如 KMT2D、NCOR2、TP53 和 LRP1B，显示出跨越负值和正值的系数分布，导致基因簇之间共享预测能力。在无进展生存期中，突变KDR、TP53、NOTCH3、PDGFRB和RET对ICI相关生存期有良好影响，而KMT2D、NOTCH1、BRAF和NCOR2等基因在基因簇之间显示出共享的预测能力。

进一步测试在这些数据上构建更复杂的模型，但数据集的基数不允许对模型进行内部验证;因此，对公开的WES和OS（活着的，已故的）和PFS（无病，复发）预测的目标数据以及ICI反应（反应，无反应）进行了外部验证。COX-Lasso选择的预测特征VAF > 0.05 和 VAF > 0.15 的 TMB 水平一起被考虑进行训练。为了更好地描述基因图谱，使用了每个基因的平均VAF值，而不是它们的突变状态。考虑了其他特征，例如VAF模式和基因共现，但由于极度不平衡而被丢弃。此外，CNV和DEL也被排除在外。随机森林建模显示ICI响应的准确率为59.3%，而对于OS和PFS，WES和MSK目标数据的准确度均不超过50%。有趣的是，大多数基因也被IMportance Perdictor(VIMP)方法证实与结果预测相关。NOTCH4基因突变的相关性最强，其与预后（OS和PFS）的负相关与突变本身的VAF成正比。如前所述，对于 ICI 反应，发现 VAF 临界值为 0.05 的 TMB 也与 OS 和 PFS 呈正相关。 综上所述，所有这些结果都证实了从晚期黑色素瘤的 CGP 图谱中得出和验证复杂生物标志物的可能性。

结论

现代精准肿瘤学通过实体瘤的综合基因组分析提供支持，可以为医生提供预测和预后基因组生物标志物，并为当前和未来的药物再利用奠定坚实的基础。通过将新的基因组靶点验证为真实世界的数据，将上述NGS panel的批准转化为新的证据。晚期黑色素瘤的回顾性多中心 CGP 队列图谱中得出和验证复杂生物标志物的可能性。