RNA-Seq: a revolutionary tool fo

RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics
RNA-Seq:转录学的革命性工具
转录组研究：从芯片到RNA-Seq
摘要：
　　新一代测序技术在爆炸式发展的同时，也衍生出许多其他技术创新。RNA深度测序（RNA-Seq）就是其中之一，这项技术使我们对细胞发育及其调控机制的理解，达到了前所未有的深度和广度。尽管研究细胞RNA并不是什么新鲜事，但RNA-Seq的出现大大拓展了转录组研究的规模，取得了累累硕果，这些是传统技术难以企及的。
生物通报道：新一代测序技术在爆炸式发展的同时，也衍生出许多其他技术创新。RNA深度测序（RNA-Seq）就是其中之一，这项技术使我们对细胞发育及其调控机制的理解，达到了前所未有的深度和广度。尽管研究细胞RNA并不是什么新鲜事，但RNA-Seq的出现大大拓展了转录组研究的规模，取得了累累硕果，这些是传统技术难以企及的。
转录组通常是指一个细胞中的所有转录本，特定发育阶段或生理条件下的转录本可以揭示许多宝贵的生物学信息。转录组学研究可以对细胞/组织的全部/部分转录组进行分析。例如，分析细胞的RNA组成并加以注释（包括编码和非编码的转录本）；检测基因结构（外显子/内含子边界、转录启示位点、剪切模式、基因融合事件等等）；帮助人们定位基因互作网络等等。不过目前最普遍的应用是，通过转录组研究来确定不同条件下转录本表达模式的改变，寻找并验证新生物学指标。
自二十世纪九十年代中期以来，芯片就是进行高通量基因组表达分析的中坚力量。这一过程包括：抽提RNA、反转录为cDNA、扩增、荧光标记和片断化。这些cDNA克隆随后被用于芯片检测，芯片上布满了相应的DNA探针。
芯片上的探针可以代表生物整个基因组或部分基因组，例如外显子、miRNA或单核苷酸多态性SNP等等。芯片上各点的信号强弱，代表了该探针目的基因（蛋白）的表达量。“这一切以杂交为中心，是一种高灵敏高特异性的途径。芯片检测的结果很容易释读，误差很小，” 美国国家儿童医疗中心的遗传医学研究中心主任Eric Hoffman说。
为了寻找影响Duchenne型肌营养不良症的调节子，Hoffman设计并订制了一个芯片。“我们通过这一芯片，可以专注于分析改变了蛋白质的多态性，从而缩小范围，使结果更易于解读，”他解释道。
芯片技术的最大局限是，构建芯片需要已知的基因组信息。对于基因数据库中没有的非编码RNA和未测序生物的RNA，就无法用芯片技术来检测其转录情况。可见，芯片技术并不是探索未知领域的理想工具。此外，芯片检测的动态范围较窄，这意味着你往往必须在高丰度转录本和低丰度转录本中做出选择，而罕见转录本的检测并不容易。除非进行特殊设计，一般芯片无法鉴别剪切突变或等位基因特异性突变。而且由于存在交叉反应，用芯片法检测高度相关的RNA种类也并不理想。
RNA-Seq
上述问题在RNA-Seq技术出现后，得到了极大改善。RNA-Seq技术可对样本中所有转录本进行多重测序，不论是否存在参考基因组，都可以获得精确到碱基的整个转录组。随着测序技术的成本持续走低，RNA-Seq正迅速成为研究基因组表达情况的首选途径。该技术能够呈现五个数量级的表达水平差异，还能检测外显子、等位基因突变以及非编码RNA等等。
不同RNA-Seq平台的读取长度不同，从36bp到400bp不等。不论是否存在参考基因组，这这些读段都可以通过软件定位，重新构成全长的转录本。
通过RNA-Seq实验可以获得相当惊人的数据量，而这恰恰是一柄双刃剑。丰富的数据量蕴含着大量的宝贵信息，但这样的数据需要进行复杂而耗时的生物信息学分析，才能从中提取到有意义的结果。因此，人们往往会在实验中进行一些预处理，以简化数据释读，例如事先挑选或去除poly-A RNA。尽管如此，RNA-Seq所生成的数据仍然比芯片要多上几个数量级。
“许多RNA测序研究都在实验设计和结果释读上遇到了麻烦，” Hoffman警告说。“RNA-Seq生成的数据量更大，灵敏度更高，动态范围更广，但这并不等于你的问题就一定能得到顺利解决。”
（Josh P. Roberts撰写/生物通编译）

参考文献：
RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics
http://www.nature.com/nrg/journal/v10/n1/abs/nrg2484.html
RNA-Seq is a recently developed approach to transcriptome profiling that uses deep-sequencing technologies. Studies using this method have already altered our view of the extent and complexity of eukaryotic transcriptomes. RNA-Seq also provides a far more precise measurement of levels of transcripts and their isoforms than other methods. This article describes the RNA-Seq approach, the challenges associated with its application, and the advances made so far in characterizing several eukaryote transcriptomes.