干湿结合的miRNA调控网络发7+也不难
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今天给大家分享2020年1月24日Elife（IF=7.551）杂志上的的文章“A regulatory microRNA network controls endothelial cell phenotypic switch during sprouting angiogenesis”。这篇文章中作者筛选构建了一个调节血管生成内皮细胞转换的miRNA，并且通过上调或下图整体miRNA以及血管相关miRNA验证，并且证明了miRNA网络通过MAP-和ERK通路完成表型的调控，最后作者将这个结论延伸到肿瘤血管生成中。
A regulatory microRNA network controls endothelial cell phenotypic switch during sprouting angiogenesis
一个控制出芽式血管生成中内皮细胞表型转换的microRNA调节网络
一.研究背景
出芽式血管（SA）生成过程中扩展的血管网络需要对许多细胞功能的协调控制，包括静态内皮细胞（EC）的激活，细胞突起，基底层和细胞外基质降解，细胞迁移和增殖，沉积新基底膜，细胞连接和细胞极性改变的过程。
血管内皮生长因子-A（VEGF-A）是最重要的细胞因子，可激活维持该形态发生过程的遗传程序。
miRNA是一类小的非编码RNA，通过靶向蛋白质编码基因的mRNA，导致mRNA降解或抑制蛋白质的表达，进而广泛调控转录后水平的基因表达。
调节网络中有miRNA，可以使细胞在不同细胞状态下转换。
miR-15a and miR-16抑制VEGF，miR-27b和miR-221维持细胞特异性分化
二.分析流程
分析流程
三.结果解读
1.VEGF-A在出芽式血管生成的3D模型中诱导内皮细胞的尖端表型
使用3D模型模拟出芽式血管生成在体外初始阶段，ECs诱导形成成椭球体，左图（SPHC）不加VEGF-A培养，为对照组；右图（SPHV）加入VEGF-A培养，为实验组。
图1A：发现对照组（SPHC）没有血管生成，而实验组（SPHV）有出芽。
图1B：对比两组实验进行基因表达分析，有3071个基因在VEGF-A处理后表达差异，说明在出芽式血管增值初期整体转录组有很大差异。其中主要为VEGFR2上调。对比两组实验的尖端细胞和茎细胞基因，表达发现实验组（SPHV）尖端标记基因大部分上调，茎细胞标记下调。
图1C：GSEA分析实验组和对照组的核心生物学通路和出芽式血管生成相关基因的变化，发现”VEGF-A应答上调基因“，“翻译”，“细胞粘附分子”，“整联蛋白途径”，“细胞外基质组织”和“胶原形成”的主要基因都在实验组（SPHV）富集。
图1. VEGF-A对内皮细胞的作用
2.早期VEGF-A反应不涉及细胞增殖
图2A：GSEA分析VEGF-A处理前后细胞周期控制基因，发现细胞周期调控基因富集于对照组（SPHC），即预示VEGF-A处理导致细胞不增殖。
图2B：KEGG信号通路分析VEGF-A处理前后细胞周期基因的表达，发现处理后细胞周期相关的52个差异基因有50个表达下调。
图2C：GSEA分析嘧啶表达富集于对照组（SPHC），图2D：GSEA分析VEGF-A处理后嘌呤表达也富集于对照组（SPHC），即DNA合成受阻。
图2E：测定PPAT酶、CAD酶和ATIC酶活性。其中PPAT酶和CAD酶为嘌呤和嘧啶核苷酸从头合成的标记物；ATIC酶催化嘌呤合成的最后一步。发现VEGF-A降低了3D模型中这三种酶的活性。（湿实验）
图2F：使用EdU+测定细胞分裂S期细胞含量，发现SPHC处于细胞静止状态，而VEGF-A不能使椭球体18小时内显著增殖（湿实验）
图2G：使用丝裂霉素C使内皮细胞有丝分裂停止（右图），但是相对左图未处理的，仍然保持迁移和形成内皮出芽的能力。
即通过湿实验验证了早期VEGF-A处理没有细胞增殖。
因此，作者通过GSEA分析、KEGG分析、实验室检验等方法，证实了在3D条件下，早期VEGF-A活性主要是针对细胞迁移而不是细胞增殖。
图2. 早期VEGF-A不作用于细胞增殖
3.依赖miRNA的调控网络维持椭球体转变成尖端细胞表型
通过小RNA测序注释出内皮细胞两种实验条件下639个水平高于阈值的成熟miRNA；
图3A：miRNA网络构建流程，通过miRNA和蛋白质编码基因共表达分析、miRNA靶基因预测、miRNA生物学关联和通路分析，构建转录后网络。
图3B：配对因子相关性分析：将miRNA和编码蛋白质表达式配对，并绘制Pearson系数。同时，使用TargetScan预测将miRNA由基因突变情况分成保守型和非保守型，再划出保守型相关系数（蓝色线条），成对的miRNA-蛋白质编码基因相互作用（红色线条），1000个有序样本随意化得到无效假设（灰色线条），发现保守型miRNA与编码的蛋白质呈负相关。即保守型miRNA上调，蛋白质编码基因靶位表达下调。
图3C：GSEA分析miRNA和特定通路调控基因的关系
图3D：GSEA分析结果：确定了5类基因组。（1）细胞外基质重塑和细胞迁移、（2）蛋白质翻译和代谢过程、（3）细胞内信号传导途径、（4）RNA和蛋白质加工、（5）细胞周期中DNA修复和MAPK级联
图3. miRNA确定与分类
图4：将上面分析五个聚类生成维持出芽式血管生成的整体转录后调控网络，左侧为上调的miRNA导致靶蛋白下调网络，右侧为下调miRNA导致靶蛋白上调网络。
图4. miRNA调节网络
4.ERK基因模块在发芽血管生成受miRNA网络调控
VEGF介导的EC增殖由ERK通路调控和迁移由p38 MAP激酶调控，因此进一步研究miRNA是否调控ERK和MAP通路
图5A：提取miRNA网络调控和MAP激酶相关的节点和靶向的miRNA，这个网络涵盖几种抑制对MAP激酶的miRNA。
图5B：实时PCR分析SPHC和SPHV中MAP激酶家族的主要成员，验证了实验组（SPHV）MAPK14上调，RAF1，MAP2K1，MAPK1和TAOK1下调
图5C：通过Meso Scale Technology测定ERK通路活性，发现VEGF使ERK通路活性降低
图5D：通过电镜观察使用ERK抑制剂（上图）和p38抑制剂（下图）后，对形成新芽迁移和迁移无影响，发现抑制ERK通路对迁移无影响，而抑制p38后形成新芽迁移和迁移能力降低。
因此，miRNA调控增殖和迁移通过ERK和MAP通路。
图5. miRNA的通路分析
5.敲减DICER拯救VEGF-A造成增殖抑制
DICER为核酸内切酶，调控miRNA，敲减后无法形成成熟的miRNA。
图6A：敲减DICER后，VEGF-A增加导致MAP激酶增加，原本VEGF-A增加MAP激酶减少。
图6B：敲减DICER后，VEGF-A增加导致ERK通路略微活性上调，原本活性下调。
图6CD：敲减DICER后，对EC形成新芽和迁移能力下降（图C上下对比）；同时， 敲减DICER后使EC对ERK抑制剂更加敏感（图C下图左右对比）
图6E：GSEA分析敲减DICER和野生型DICER在基因表达谱，发现敲减DICER在VEGF-A刺激条件下细胞周期和核苷酸代谢相关基因高于未野生型水平。
图6F：EdU测定有丝分裂S期细胞比重，敲除后S期占比高，即VEGF-A依赖性的细胞增殖增加。
图6. 整体miRNA失表达对增殖影响
6.miRNA枢纽网络调控发芽血管生成的生物学验证
通过之前的文献报道挑选血管控制相关的 miR-424–5p 和 miR-29a-3p进行生物学验证。
图7AB：展示miR-424–5p 和 miR-29a-3p在调节网络中控制的基因，其中miR-424–5p和MAPK通路以及细胞周期相关，而miR-29a-3p则和细胞重塑相关
图7CD：使用外源的DAPT（DDL4的抑制剂）和DDL4（在血管生成中高表达的基因），DAPT上调miR-424–5p 而下调miR-29a-3p；DDL4则相反。
图7EF：通过使用miR-424–5p 和 miR-29a-3p的模拟物上调或者使用抑制剂下调miR-424–5p 和 miR-29a-3p的水平，发现无论上调下调均损害了EC的血管出芽能力，表明miR-424–5p 和 miR-29a-3p在合适范围内才最佳。
图7GH：通过miR-424–5p 和 miR-29a-3p的模拟物上调，验证miR-424–5p 和 miR-29a-3p的靶基因情况，上调后导致对应的靶基因下调。
图7. 血管生成相关miRNA过表达或失表达对血管生成的影响
7.调节miRNA枢纽改变网络的结构
通过对miRNA调节的整体分析解释miRNA上调和下调的非对称效应。
图8A：TaqMan阵列分析miR-424–5p 和 miR-29a-3p过表达和低表达时，整体miRNA中有多个miRNA改变。
图8B：根据miRNA网络筛选出和miR-424-5p或miR-29a-3p有共同靶基因的miRNA，发现也有大量改变。
图8. miR-424–5p和miR-29a-3p变化导致整体miRNA的变化
8.在发芽血管的生成中，miRNA靶向基因上调和肿瘤血管生成有关
作者引入内皮细胞细胞评分概念，血管生成中的内皮细胞评分高。
图9A：GSEA分析miR29a-3p与不同内皮评分大肠癌之间关系，发现miR29a-3p靶子集富集在内皮评分较高的CRC。
图9B：网络分析上调的模块与内皮评分正相关。
图9C：GSEA分析上调的模块与不同内皮评分大肠癌的关系，上调的模块富集在评分高的CRC。
图9D：GSEA分析对VEGF阻断剂敏感与不敏感与上调的模块的关系，发现上调模块在VEGF阻断剂敏感型富集。
图9. 发芽血管与大肠癌血管生成的联
最后小结一下，作者通过对比有无VEGF-A处理培养的内皮细胞，发现两组细胞基因表达水平很大差异，且表达的基因在生物学功能上很大不同，进而作者深入研究这种不同表达的机制，发现有miRNA调控网络调控这ECs的表型转换，随后作者利用miRNA以及两个血管生成相关的miRNA过表达或失表达验证这个模型，最后作者分析了miRNA网络与中肿瘤血管生成的关系。
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