450k甲基化基础（一）

• 基本概念

1. 什么是DNA甲基化

DNA甲基化是表观遗传学的中最为常见的一种修饰，其主要形式包括：5-甲基胞嘧啶 (5-mC)、少量的N6-甲基腺嘌呤 (N6-mA) 以及7-甲基鸟嘌呤(7-mG)。

目前常说的DNA甲基化一般指CpG岛甲基化，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变为5’甲基胞嘧啶。

哺乳动物体细胞的DNA胞嘧啶甲基化主要发生在CpG岛
CpG岛（CpG islands）:指CpG序列密度相比整个基因组来说是特别高的富集区域，一般位于启动子附近，5’端非翻译区或第一个外显子；一般CpG岛序列长度在500bp以上，GC含量高于55%以及CpG出现比率大于0.65，40%的启动子区域含有CpG岛。

CpG shores指距CpG岛边缘2kb的区域
CpG shelves是指距CpG岛边缘4kb的区域

哺乳动物中的非CpG甲基化主要是发生在胚胎发育阶段和脑组织中

基因组中60%-90%的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG形成CpG岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点

• DNA甲基化的作用

一般来说，DNA甲基化主要作用在于调控基因的表达，即基因启动子区域CpG岛的甲基化水平越高，其对应基因的表达水平就相对越低；DNA甲基化受到甲基化酶（如DNMT3A）和去甲基化酶（TET2）的调控。

在转录水平的抑制机制一般存在以下几点：

• DNA胞嘧啶甲基化后改变了DNA的空间构想，导致转录因子无法正常地与DNA结合，从而导致转录水平下降
• 甲基化DNA与MeCP家族结合，改变了染色质的结构，抑制基因转录的发生
  CpG岛的异常甲基化导致一些组蛋白发生去乙酰化，从而改变了染色质的结构（使空间高度螺旋化），失去转录活性
  -除了对转录水平抑制外，在一些肿瘤研究中发现DNA甲基化会导致一些癌基因表达量的上升；
• 在正常人基因组中，CpG岛中的CpG通常是非甲基化的，而CpG岛外的CpG则一般是甲基化的；当肿瘤发生后，CpG岛局部发生高甲基化以及基因组则呈现DNA低甲基化；前者会导致抑癌基因表达量下降，从而使得癌细胞形成以及存活效率上升，后者则会导致癌基因甲基化水平降低而活化，以及一些转座子的活化进而导致染色体稳定性下降，最终导致恶性肿瘤的发生。

除了CpG岛的甲基化水平的变化会导致肿瘤的发生外，CpG shores and shelves的异常甲基化也会导致其基因转录水平的抑制

甲基化芯片原理

甲基化芯片的原理是基于亚硫酸盐处理后的DNA序列杂交的信号探测，亚硫酸盐处理是将非甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，然后再将尿嘧啶转化为胸腺嘧啶，最后进行芯片杂交；
Illumina的450K芯片采用两种assay：Infinium I和Infinium Ⅱ，前者有两种bead（微珠），分别是甲基化M和非甲基化U，后者则是一种bead（不区分甲基化和非甲基化）。
以及下面这张图，注：左边一列是非甲基化的GpC locus，右边是甲基化的GpC locus，上下分别是Infinium I 和Infinium Ⅱ

如上方图：Infinium I，在未甲基化的GpC locus，U型bead尾部为A，与未甲基化CpG位点相匹配，能够成功进行单核苷酸延伸并被检测到（U型磁珠发光），而M型bead尾部为G，与未甲基化位点不能匹配，没有信号产生；在甲基化的GpC locus，M型bead能与甲基化CpG位点相匹配，单核苷酸延伸并产生信号（M型磁珠发光），而U型bead则不匹配，不产生信号
如下方图：Infinium Ⅱ探针则不区分M和U，探针尾部为C，配对后只加入单个碱基（ddNTP-BioT， ddNTP-DNP），然后根据荧光颜色判断加入碱基的类型，进而确定该位点是否被甲基化
探针长度为50bp，基于假设在50bp内的CpG位点具有相同的甲基化状态，具有区域相关性
通过计算甲基化和非甲基化位点的荧光信号比例，可确定某位点的甲基化水平（Beta值=M/(M+UM)）

探针是以甲基化位点为单位的，每个探针对应检测一个甲基化位点。为了能够区分甲基化位点和非甲基化位点，在450K 和 850K中，有两种类型的探针，分别叫做I 型探针和 II 型探针

image.png

对于human 来说，目前主流的DNA甲基化芯片有450K 和 850K 两种，都是illumina 公司研发的。这里的450K 和 850K 指的是芯片上探针的数量，对应可以检测的甲基化位点个数。

image.png

—————————————————————————————————————

对于亚硫酸氢盐处理的DNA ，非甲基化的C会变成T , 而甲基化的C不会变。
对于I 型探针而言，有两种序列，专业名词叫做bead type， 其中Unmethylated bead type 用来和非甲基化的C杂交，Methylated bead type 用来和甲基化的C杂交。

下面是450K 上一个 I 型探针的示例：

ID cg00050873
AlleleA_ProbeSeq ACAAAAAAACAACACACAACTATAATAATTTTTAAAATAAATAAACCCCA
AlleleB_ProbeSeq ACGAAAAAACAACGCACAACTATAATAATTTTTAAAATAAATAAACCCCG

可以看到两种bead type 只有末端最后1个碱基不同，A 碱基用来杂交非甲基化的C, G碱基用来杂交甲基化的C。

对于II 型探针而言，设计的比较巧妙，它只需要1个bead type, 探针只涉及到甲基化位点的前一个碱基，在DNA 链的延伸阶段，根据延伸的碱基是A 还是 G , 从而判断是甲基化的C 还是非甲基化的C。

下面是450K 上一个II 型探针的示例：

ID cg00035864
AlleleA_ProbeSeq AAAACACTAACAATCTTATCCACATAAACCCTTAAATTTATCTCAAATT

可以看到只有1种bead type。

总结

对于human而言，主流的DNA甲基化芯片有450K和850K两种，这两个数字代表覆盖到的甲基化位点的个数，是一个约数；
甲基化芯片上混合使用了I 型探针和II 型探针，I 型探针通过两个bead type 分别识别甲基化的C和非甲基化的C，II 型探针通过1个bead type 就可以区分甲基化的C和非甲基化的C。

---

一、Illumina HumanMethylation450 BeadChip （甲基化450k芯片）简介

450K芯片的芯片图形及其原理可以以下图展示

image.png

1、芯片：一张芯片包括12个array（如图显示），也就是一张芯片可以做12个sample，一台机子一次可以跑8张芯片，也就是一共96个sample，每个样本可以测到超过450，000个CpG位点的甲基化信息（大概人所有的1%，但是覆盖了多数CpG岛和启动子区），芯片本身包含一些控制探针可以做质控。
2、原理：简而言之，基于亚硫酸盐处理后的DNA序列杂交的信号探测。亚硫酸盐是甲基化探测的“金标准”，不管是芯片或者甲基化测序，都要先对DNA样品进行亚硫酸盐处理，使非甲基化的C变成U，而甲基化的C保持不变，从而在后续的测序或者杂交后区分出来。450K采用了两种探针对甲基化进行测定，Infinium I采用了两种bead（甲基化M和非甲基化U，如图显示），而II只有一种bead（即甲基化和非甲基化在一起），这也导致了它们在后续荧光探测的不同，450K采用了两种荧光探测信号（红光和绿光）。

二、分析需要考虑的问题
1、背景校正
2、红光和绿光的校正
3、控制芯片的使用（illumina450K本身有一些控制芯片，可以用来做质控，如亚硫酸盐处理效率）
4、探针类型（I型和II型）的校正（不同探针类型产生的数据不同）
最终我们选择BMIQ的方法（基于ebayes的原理将II型探针的甲基化水平拉伸到I型水平）来做矫正。
5、位置的校正（芯片上的不同位置产生的数据可能会有偏差）
6、批次的校正（不同的批次做的数据会有偏差）
7、探针序列本身是否可靠（有些探针本身位于repeat区或者包含snp等就会影响杂交及最后的结果，应该去除，附上一片参考文献，里边有list可以用来去除不好的探针）

平均β=信号B /(信号A +信号B + 100)
通过计算甲基化（信号A）和未甲基化（信号B）等位基因之间的强度比来确定DNA甲基化水平（β值）。
具体地，β值是由甲基化（M对应于信号A）和未甲基化（U对应于信号B）等位基因的强度计算的，荧光信号的比率β= Max（M，0）/ [Max（ M，0）+ Max（U，0）+ 100]。
因此，β值的范围从0（完全未甲基化）到1（完全甲基化）

具体的β值的意义是：

任何等于或大于0.6的β值都被认为是完全甲基化的。
任何等于或小于0.2的β值被认为是完全未甲基化的。
β值在0.2和0.6之间被认为是部分甲基化的。

参考：
http://www.biotrainee.com/thread-237-1-1.html
http://www.bioinfo-scrounger.com/archives/430