【软件安装】---MinION-based pipeline--

前言：ONT，即Oxford Nanopore Technologies，划时代的纳米孔测序技术。ONTrack是一个用来分析MinION测序数据的pipeline，源码在GitHub里（戳👉：github.com/MaestSi/ONTrack）。

1.安装前准备
1.1 安装conda
首先确认服务器安装了conda，没有的先安装conda：

wget https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
chmod 755 Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
./Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh

1.2 安装guppy
guppy是nanopore官方提供的basecalling软件，安装步骤如下：

wget https://mirror.oxfordnanoportal.com/software/analysis/ont-guppy-cpu_version_of_interest.tar.gz
tar -xf ont-guppy-cpu_version_of_interest.tar.gz

下载的guppy软件包解压之后，会产生一个ont-guppy-cpu文件夹，在安装好ONTrack之后，你需要把ont-guppy-cpu/bin的绝对路径作为BASECALLER_DIR变量添加在config_MinION_mobile_lab.R这个文件里。
1.3 安装blast nt数据库（可选）
这一步是非必要的，你可以选择下载nt数据库，用于本地化blast。nt数据库非常大，65个G左右，建议先跳过这一步。安装步骤如下：

mkdir NCBI_nt_db
cd NCBI_nt_db
echo `date +%Y-%m-%d` > download_date.txt
wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/nt*
targz_files=$(find . | grep \.tar\.gz$ | sed 's/\.\///g')
for f in $targz_files; do tar -xzvf $f; done
rm $targz_files

同样，在安装好ONTrack之后，你需要把NCBI_nt_db/nt的绝对路径作为NTDB变量添加在config_MinION_mobile_lab.R这个文件里。（PS：NT数据库下载链接：ftp.ncbi.nih.gov/blast/db）

2.安装ONTrack
安装步骤：

git clone https://github.com/MaestSi/ONTrack.git
cd ONTrack
chmod 755 *
./install.sh

运行install.sh之后，会创建一个名叫ONTrack_env的conda环境，同时在该环境中安装blast, emboss, vsearch, seqtk, mafft, minimap2, samtools, nanopolish, bedtools, pycoQC以及R with package Biostrings。
这些软件缺一不可（手动捂脸），如果后面运行报错，八成是有的软件没装好，可以自己手动安装，并在config_MinION_mobile_lab.R这个文件里设置好路径。

3.ONTrack的使用
先上流程图，各位看官请欣赏：

ONTrack的工作流程
主要的用法是：

Usage: Rscript ONTrack.R <home_dir> <fast5_dir> <sequencing_summary.txt>

Inputs：

<home_dir>: directory containing fastq and fasta files for each sample named BC<numbers>.fast*
<fast5_dir>: directory containing raw fast5 files for nanopolish polishing, optional
<sequencing_summary.txt>: sequencing summary file generated during base-calling, used to speed-up polishing, optional

输入文件是fastq时，必须把对应的fasta也放在同一目录，可以用李恒的seqkt生成对应的fasta，命令如下:

seqkt seq -A sample.fastq > sample.fasta

Outputs：

<"sample_name".contigs.fasta>: polished consensus sequence in fasta format
<"sample_name".blastn.txt>: blast analysis of consensus sequence against NCBI nt database (if do_blast_flag variable is set to 1 in config_MinION_mobile_lab.R)
<"sample_name">: directory including intermediate files

小结：运行一个fastq试了一下，大概跑30分钟左右，主要的结果就是"sample_name".contigs.fasta，一个经过严格计算的一致序列，可以用来在NCBI中去blast。我现在就等着60多G的nt数据库下载完了，祝我好运吧！