【陈巍学基因-7】长测序

2018-12-28 本文已影响45人 oddxix

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Moleculo原来是美国的一家创业公司。这家公司开发了一种拼接长测序序列的方法。这个方法一经面世，就引起了Illumina的重视，Illumina马上出巨资，收购了这家公司。

在收购了Moleculo之后，Illumina把这个方法进行了优化。优化之后，以“TruSeq Synthetic Long-Read DNA Library Kit”的形式，出现在Illumina的新产品当中。在全新的基因组组装工作中，也就是我们通常所说的“De Novo”工作中，最核心的技术点，是能否得到大量的、长读长的序列。所以，得到长的读长序列，一直是做De novo工作的科学家所追求的有效技术手段。另外，长读长的序列还可以帮助科学家来确定染色体单体的基因型。

Illumina标准的HiSeq/MiSeq测序方法，提供了一次给出大量序列的方法。它的序列，精度也很高，每个G的数据的测序成本也很低，但是，相对于De novo工作来说，它的读长还是不够长。举例来说，Illumina旗下测序长度最长的MiSeq测序仪它的测序长度是：双端各300个碱基。那么，我们把这双端的300个碱基拼起来，中间交错100个碱基，可以得到一个500碱基的读长，那么，我们要用500碱基读长的序列来组装一个和人类基因组大小相近的一个基因组，也就是单倍体长度为30亿个碱基长度的基因组，就相当于用筷子那么长（25厘米）的铁轨，来拼出一个京沪铁路（1300公里）。

Moleculo方法，它的巧妙点就是可以把Illumina不算太长的序列，拼接成一个一个10KB读长的序列，然后，再拼出基因组来。

第一步，分拆

首先是把长片段的基因组DNA，也就是40KB以上的长片段的基因组DNA，打断成10KB左右的DNA片段。这个打断的过程，是用Covaris公司出品的g-TUBE方法来打断的。g-TUBE可以把长的基因组DNA，打断成5KB-20KB长度的片段。

打断了的DNA片段，末端大多数不是平齐的。接下来，就要用酶把这个末端给补平。补平的过程，是用T4 DNA聚合酶、和Klenow聚合酶，两者的混合酶来进行补平。然后，再用T4 DNA寡核苷酸激酶，在5'端统一地加上磷酸基团。补平之后，再用去掉了3'端外切酶活性的Klenow大片段聚合酶来进行处理。

这样，可以在每个片段的两个3'端，都各加上一个A碱基。加好了A碱基之后再用连接酶，在DNA片段的两端连上第一步的PCR接头。连好接头的DNA片段，走琼脂糖凝胶，切胶回收10KB左右的DNA片段。回收下来的DNA片段，用qPCR进行精确定量。

第二步，扩增

用qPCR精确定量好之后的DNA片段，做成一个长PCR的Master Mix。然后，把这个Master Mix分散到384孔PCR板里面，进行长PCR。

那么这里有一个注意点：就是如果是用来做De novo的文库，那么稀释到384孔的每一个小孔里，是3个fg（1 fg = 1 * 10^-15 g）的DNA。而如果是做染色体（单体）基因分型的，则是稀释到每个小孔75个fg的DNA。

之所以做De novo的这个PCR，要用更稀的模板，是因为，不希望一个小孔里面的片段，相互之间有交叠。接下来，做长PCR在做长PCR的时侯，如果是用来做De novo的是做21个循环，而如果是做染色体基因分型的，则是做15个循环。

这个区别，是因为之前的两种反应，所加的起始模板量是不一样的。那么，现在要在PCR的环节当中，通过循环数的不一样，把DNA的最终产量，给拉平。

第三步，Nextera建库、测序

接下来，就用Nextera方法，对扩增好的片段，进行打断，并加上末端标签。

Nextera打断的原理，是用结合了DNA标签的转座酶，和之前扩增得到的10KB的DNA片段进行反应。转座酶，一方面，会把长片段给切断成短的小片段。另一方面，它也会把酶本身结合了的DNA标签，连在切出来的小片段DNA的末端上。这个新加上的DNA标签，就成了接下来PCR扩增的引物结合序列。再接下来，就是加入有P5、P7测序引物序列，同时带有Index序列的PCR引物，进行新的一轮PCR扩增。