软件：

比对：mafft
建树：phyml
可视化：itol

1.下载软件

conda install mafft
conda install phyML

2.利用mafft对蛋白序列进行多序列比对

该软件的基本用法如下

mafft  input > output

input为fasta格式的输入序列文件，output为fasta格式的输出结果文件。mafft 支持核酸和蛋白序列的多序列比对，内置了多种序列比对算法， 可以分为以下3大类别

1. consistency based methods
2. iterative refinment methods
3. progressive methods
   这三种类别的算法在准确度和速度上各有优势，对于运行速度而言，3>2>1;对于准确度而言，1>2>3。
4. consistency based methods
   此类算法包含了L-INS-i, E-INS-i, G-INS-i 3种算法。
   L-INS-i 用法如下

mafft --localpair --maxiterate 1000 input_file > output_file

E-INS-i 用法如下

mafft --genafpair --maxiterate 1000 input_file > output_file

G-INS-i 用法如下

mafft --globalpair --maxiterate 1000 input_file > output_file

2. iterative refinment methods

此类算法包含了FFT-NS-i, NW-NS-i 两种算法。

FFT-NS-i 用法如下

mafft --maxiterate 1000 input_file > output_file

NW-NS-i 用法如下

mafft --maxiterate 1000 input_file > output_file

3. progressive methods

此类算法包含了FFT-NS-1, FFT-NS-2 2种算法。
FFT-NS-1 用法如下

mafft --retree 1 input_file > output_file

FFT-NS-2 用法如下

mafft --retree 2 input_file > output_file

如果在比对时，不知道如何选取合适的算法，可以使用以下设置

mafft --auto input > output

软件会根据输入序列的特征，自动选择合适的算法。

在linux下mafft提供交互式的界面

图片.png

软件会对你进行引导
（1）输入文件的路径，需要标准的fasta格式
（2）输出文件的路径
（3）选择输出文件的格式，输入对应序号按回车即可，支持Clustal、Fasta
（4）选择比对策略，输入对应序号按回车即可，通常选择1

图片.png

（5）附加参数，如果没有，直接按回车即可

rehash # if necessary
mafft sample > test.fftns2 # FFT-NS-2
mafft --maxiterate 100 sample > test.fftnsi # FFT-NS-i
mafft --globalpair sample > test.gins1 # G-INS-1
mafft --globalpair --maxiterate 100 sample > test.ginsi # G-INS-i
mafft --localpair sample > test.lins1 # L-INS-1
mafft --localpair --maxiterate 100 sample > test.linsi # L-INS-i

3.PhyML 建树
PhyML　的输入文件为 phylip 格式。

PhyML -i proteins.phy -d aa -b 1000 -m LG -f m -v e -a e -o tlr

常用参数：
-i seq_file_name
输入文件，phylip 格式的多序列比对结果。
-d data_type default：nt
该参数的值为 nt, aa 或 generic。
-b int
设置 bootstrap 次数。
-m model
设置替代模型。 核酸的模型有： HKY85（默认的）, JC69, K80, F81, TN93, GTR ; 氨基酸的模型有：LG （默认的）, WAG, JTT, MtREV, Dayhoff, DCMut, RtREV, CpREV, VT, Blosum62, MtMam, HIVw, HIVb 。
-f e,m or fA,fC,fG,fT
设置频率计算的方法。 e 表示使用比对结果中不同氨基酸或碱基出现的频率来计算； m 表示使用最大似然法计算碱基频率，或使用替换模型计算氨基酸频率； fA,fC,fG,fT 则是 4 个浮点数，表示 4 中碱基的频率，仅适合核酸序列。
-v prop_invar
设置不变位点的比例，是一个[0,1]区间的值。或者使用 e 表示程序获得其最大似然估计值。
-a gamma
gamma 分布的参数。此参数值是个正数，或者使用 e 表示程序获得其最大似然估计值。在 ProtTest 软件给出的最优模型中含有 G 时，使用该参数。
-o params
参数优化的选项。t 表示对 tree topology 进行优化； l 表示对 branch length 进行优化； r 表示对 rate parameters 优化。
params=tlr 这表示对 3 者都进行优化。 params=n 表示不进行优化。

4. PhyML 结果

PhyML 的输出结果为：

proteins.phy_phyml_tree.txt        :    最大似然法构建的进化树
proteins.phy_phyml_boot_stats.txt  :    bootstrap 的统计信息
proteins.phy_phyml_boot_trees.txt  :    bootstrap 树
proteins.phy_phyml_stats.txt       :    程序运行的中的参数和结果统计

5.itol可视化