根癌农杆菌介导转化的原理及应用
农杆菌介导转化技术是指将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株的技术。
Ti质粒
Ti 质粒有两个区域：
①T-DNA 区（是质粒上能够转移整合入植物受体基因组并能在植物细胞中表达从而导致冠瘿瘤的发生，且可通过减数分裂传递给子代的区域）和 Vir区（编码能够实现 T-DNA 转移的蛋白）。
T-DNA 长度为 12-24kb 之间，两端各有一个含 25hp 重复序列的边界序列，在整合过程中左右边界序列之间的 T-DNA 可以转移并整合到宿主细胞基因组中，研究发现只有边界序列对 DNA 的转移是必需的，而边界序列之间的T-DNA 并不参与转化过程，因而可以用外源基因将其替换。
②Vir 区位于 T-DNA 以外的一个35kb 内，其产物对 T-DNA 的转移及整合必不可少。农杆菌侵染植物首先是吸附于植物表面伤口，受伤植物分泌的酚类小分子化合物可以诱导 Vir 基因的表达。Vir 产物能诱导 Ti 质粒产生一条新的 T-DNA 单链分子。此单链分子从 Ti 质粒上脱离后，可以与 Vir 产物 VIRD2蛋白共价结合，并在 VIRD4 和 VIRB 等蛋白的帮助下从农杆菌进入植物细胞的染色体中。
③ Con区（regions encoding conjugations）
该区段上存在着与细菌接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移， 因此称之为接合转移编码区。
④ Ori区（origin of replication）
该区段基因调控Ti质粒的自我复制， 故称之为复制起始区。
T-DNA 转移整合进受体基因组中有两种方式，一种是同源重组，利用片段间的同源性定向置换掉目的基因，是进行基因功能研究的重要方法（基因定向敲除或替换）。而另一种方式是异常重组，即 T-DNA 的整合插入是随机无规则的。
T-DNA 转移机制
首先AS诱导膜蛋白VirA 形成复合物，使VirG 磷酸化，激活Vir 区转录出核酸内切酶VirD1 和VirD2，2 种内切酶分核酸内切酶VirD1 和VirD2，2 种内切酶分别在 LB 和RB 的第3 个碱基和第4 个碱基之间进行切割，并持续发挥作用。T-DNA 的被切割片段从Ti 质粒中释放出来，产生单链DNA 分子(T 链)，这些分子在其5'端共价连接到VirD2 形成共价复合物(VirD2-T 链)，紧接着与VirD5、VirE3、VirE2等蛋白结合形成T-DNA 复合体，同时，VirD4 与VirB 形成T4SS-VirB/D4 通道复合体，进而形成T4 细胞通道，T 复合体在VirF 蛋白的辅助下通过T4 细胞通道进入宿主细胞，在宿主细胞内发生分解，T 链在VirD2 的牵引下作为线性非置换片段进入宿主细胞核，整合到宿主基因组中，因此能在宿主中稳定存在和遗传。
T-DNA 转移机制
ATMT 流程图
双元载体系统(二元系统)
双元载体由含有T-DNA 的多功能克隆质粒和含有Vir 区的Ti 衍生质粒构成，均位于根癌农杆菌内，前者负责在大肠杆菌和根癌农杆菌内进行复制和运载T-DNA 边界内的DNA 序列(目的基因及标记基因)，后者提供反式毒性区功能，催动T-DNA 的转移。
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常用的双元载体有pBI-121、pBNI19、pGreen、pCAMBIA系列等，通常以这几种载体为基本骨架通过更换启动子、更换抗性基因、重组进目的基因等方式构建出适用的双元载体。
除常用骨架外，通常利用glaA、gpdA、cbh、trpC 等启动子启动目的基因，并以潮霉素磷酸转移酶基因为标记基因。
由于双元表达载体分为两部分，所以选择载体需要与脓杆菌适配！
技术优势：
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1.查询双元载体
参考文献：T-DNA Binary Vectors and Systems
- 查询ATMT技术成功转化的真菌种类
参考文献：根癌农杆菌介导真菌遗传转化的研究及应用
应用案例1. Target-gene replacement and randominsertional mutants
文献：1. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation: An efficient tool for insertional mutagenesis and targeted gene disruption in Harpophora oryzae
- Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Beauveria bassiana using an herbicide resistance gene as a selection marker
As the fluorescent cassette was lost after the homologousrecombination event, gene knockout mutants could be distin-guished from transformants with random insertion in the aid offluorescence microscope (Fig. 4A).
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Figure legend: (A) Two types of transfomants after ATMT. The GFP cassette will be degraded in the putative gene deletion mutants because of the homologous recombination event. However, the GFP cassette still remains in the random insertional transformants.
应用案例2.过表达和敲除菌株
文献：mro-miR-33在绿僵菌产孢中的作用
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应用案例3.敲除绿僵菌Mest1基因
文献：1. Insertion of an esterase gene into a specific locust pathogen (Metarhizium acridum) enables it to infect caterpillars
For targeted deletion of Mest1, the 59 and 39 flanking regions of the Mest1 ORF were amplified by PCR from Mr2575 genomic DNA, and then subcloned into the XbaI and SpeI sites of the binary vector pBarGFP . The gene disruption construct (pBarGFPMest1) was then transformed into Agrobacterium tumefaciens AGL-1 for targeted gene disruption by homologous recombination as described previously.
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文献： Insects defend against fungal infection by employing microRNAs to silence virulence-related genes
Target gene deletion mutants were constructed using a conventional gene targeting method by homologous recombination. The 5′ and 3′ flanking regions of the sec2p and C6TF were PCR amplified, and cloned into XbaI and EcoRV sites of the binary vector pBarGFP, respectively (5). The gene deletion constructs (pBarGFP-sec2p, pBarGFP-C6TF) were separately transformed into A. tumefaciens AGL-1 for targeted gene deletion in B. bassiana by homologous recombination (4). For gene deletion mutant screening, replacement-specific PCR was performed with specific primer pairs (Table S3) for each gene.
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Figure legend: (A) Schematic representation of a target B. bassiana gene and the plasmid pBarGFP that was used for gene disruption via homologous recombination. The primer pairs FP1 and RP1 were used to amplify WT genome DNA fragment, FP2 and RP2 were used to verify the deletion mutants.
参考文献：
根癌农杆菌介导真菌遗传转化的研究及应用
根瘤农杆菌专题
农杆菌的T-DNA是如何整合进植物基因组的？
遗传转化的基本知识（四）——植物遗传转化的载体系统
