肿瘤细胞通过RB1CC1介导的转录重编程对铁死亡敏感
在癌症领域研究中，铁死亡是一种受调节的细胞死亡形式，使肿瘤细胞对铁死亡敏感的信号通路和因素未探究清楚。触发铁死亡可以有效地治疗对促凋亡和其他常规抗肿瘤治疗耐药的肿瘤细胞。因此，全面研究信号网络和引起铁死亡的相关因素对于制定有效策略使肿瘤细胞对铁死亡敏感并开发有效的基于铁死亡治疗至关重要。
凌恩生物客户同济大学医学院附属上海第十人民医院近期在《Clinical and Translational Medicine》期刊(IF=10.892)发表“Tumour cells are sensitised to ferroptosis via RB1CC1-mediated transcriptional reprogramming”研究论文，确定了RB1CC1是肿瘤细胞中感知铁死亡的关键调节因子，并提出了一种新的铁死亡相关调节信号通路的新思路。
期刊：Clinical and Translational Medicine
影响因子：10.892
发表时间：2022
样本类型：肿瘤细胞
客户单位：同济大学医学院附属上海第十人民医院
一、实验设计
通过测量细胞死亡和脂质活性氧（ROS）的产生来确定细胞中的铁死亡水平。通过对肝癌细胞进行RNA-seq和蛋白质组检测，确定目标分子RB1CC1。后续通过免疫印迹和免疫组织化学分析RB1CC1和相关蛋白的表达。
通过ChIP-seq检测肿瘤细胞中的铁死亡和RB1CC1的转录程序。最后，构建了肝癌小鼠模型，来评估JNK激动剂对一种铁死亡诱导剂(IKE)治疗的影响，
图 实验设计
二、实验结果
1、RB1CC1使肿瘤细胞对铁死亡敏感
为了筛选潜在的脂质ROS调节和铁死亡相关因子，作者对erastin（脂质ROS和铁死亡诱导剂）和Fer-1（脂质ROS和铁死亡抑制剂）处理的肝细胞癌（HCC）HepG2细胞进行了RNA-seq和蛋白质组学研究。结果获得了六个候选分子，其中沉默RB1CC1产生了最显著的效果（图1），即对铁诱导的细胞死亡变得不敏感。
作者继续评估了用RSL3（铁死亡诱导剂）和erastin处理的一系列癌细胞系中RB1CC1的表达，发现在HepG2、结肠癌HCT29等多种癌细胞中RB1CC1以时间依赖性方式上调（图1C-D）。在用RSL3和erastin处理的HepG2细胞中，自噬体形成的没有显著增强（图1E）。结果表明，RB1CC1通过不依赖自噬的方式对铁死亡敏感。
为了探索 RB1CC1 在体内的作用，作者在预给药IKE 2天后，通过剖宫产获得RB1CC1纯合缺失的小鼠胎儿，发现IKE介导的胎儿的丙二醛和4-HNE不如WT组强（图 1G-I），证明了铁死亡相关的脂质过氧化是RB1C1依赖性的。此外，RB1CC1敲除组的IKE并不像对照组那样抑制肿瘤生长并诱导脂质过氧化（图 1J-L）。
图1 RB1CC1使肿瘤细胞对铁死亡敏感
2、核易位的RB1CC1作为铁死亡调节转录因子
为了探究RB1CC1 如何参与铁死亡的信号调节，通过RB1CC1的KO（敲除）或过表达（OV）减轻或增强RB1 mRNA表达（图2A），这表明RB1CC1可能作为转录因子，在触发铁死亡时增强靶基因的转录。
随后通过ChIP实验，发现 RB1CC1 被募集到用RSL3和erastin处理细胞中的 RB1 启动子中的 RB1CC1 结合区 (RBR)（图 2B）。RB1CC1在触发铁死亡后1小时从细胞质转移到细胞核，并在HepG2细胞中在处理后4小时变得明显（图2C）。HepG2细胞的细胞分级实验进一步证明了RB1CC1的铁死亡诱导的核易位（图2D）。
通过磷酸化蛋白凝胶检测，发现RB1CC1中的499-548位氨基酸区域对于铁死亡诱导的RB1CC1核易位至关重要（图 2E），S537A突变能消除了RSL3和erastin治疗后RB1CC1的超移（图 2F-H），细胞定位实验和细胞死亡检测也均表明RB1CC1在S537残基处以铁死亡依赖的方式被磷酸化（图 2I-J）。
以上证明RB1CC1的铁死亡诱导的核易位与S537残基的磷酸化有关，对肿瘤细胞的铁死亡敏感至关重要。
图2 RB1CC1的核易位使细胞对铁死亡敏感
3、RB1CC1涉及H4K12Ac组蛋白修饰在刺激增强子依赖性转录中的新作用
为了探索铁死亡触发后其转录活性的机制，作者进行了免疫沉淀（IP）和蛋白质组学。组蛋白H4被鉴定为RSL3-和erastin诱导的RB1C1相关蛋白质。组蛋白乙酰化与转录重编程密切相关。作者评估了RB1启动子内RBR周围的两种主要组蛋白H4修饰H4K12Ac和H4K16Ac，发现H4K12Ac水平以铁死亡和RB1C1依赖的方式升高（图3B），而H4K16Ac水平没有变化。这些结果表明，RB1CC1可能通过增加H4K12C组蛋白修饰水平参与铁死亡。
在HepG2细胞中使用抗rb1cc1和抗h4k12ac抗体进行ChIP-Seq来检测肿瘤细胞中的铁死亡和RB1CC1依赖性转录程序，发现与RSL3和erastin有关的RB1CC1占据了5个新的峰，并伴随着H4K12Ac组蛋白修饰的显著增加（图 3C-E）。通过基序分析和荧光素酶报告实验，表明铁死亡诱导的增强子活性可能依赖于RB1CC1与FOX基序的相互作用（图 3F-G）。
根据RNA-seq结果，RSL3处理后SEC3、CYTH3、MEPCE、CYREN、CHCHD3、TPD52、SLC25A32、MYC和VRK3表达上调，是潜在的铁死亡相关基因（图 3H）。通过3C实验确定了RB1cc1相关增强子和铁死亡相关基因启动子之间的相互作用（图 3I-J）。
这些结果揭示了增强子结合对于RB1CC1刺激铁死亡相关基因的表达至关重要。
图3 RB1CC1与H4K12Ac连接，介导铁死亡相关和增强子依赖的转录
4、RB1CC1 通过其靶基因调节线粒体和铁死亡
GO富集发现九个铁死亡相关基因中的三个（图3H）被预测与线粒体相关，其中两个被预测参与线粒体内膜组织（图4A）。这表明RB1CC1可能通过其靶基因CHCHD3以线粒体依赖的方式使细胞对铁死亡敏感（图 4A-C）。在缺乏线粒体DNA的细胞系中过表达CHCHD3，发现线粒体至少是RB1CC1和CHCHD3对铁死亡敏感的关键（图 4D-F）。
根据MMP和细胞死亡检测，RSL3和erastin处理后，CHCHD3敲除使RB1CC1对MMP的刺激无效（图 4G-J）。小鼠模型体内实验进一步证明，IKE诱导的Chchd3表达是Rb1cc1依赖的，同时，Rb1cc1对于RSL3和erastin诱导的Chchd3的上调是不可或缺的（图 4K-M）。
因此，CHCHD3作为RB1CC1的下游效应分子，决定了线粒体功能和铁死亡。
图4 RB1CC1靶基因与线粒体相关
5、ELP3与RB1C1相互作用以调节H4K12C组蛋白修饰和铁死亡相关转录程序
通过蛋白组学检测寻找RB1C1相关的组蛋白调节因子，结果发现了48种RSL3诱导的H4相关蛋白和143种erastin诱导的H3相关蛋白（图 5A）。ChIP和Re-ChIP实验表明，RSL3和erastin处理后，两种与线粒体相关RB1CC1靶基因CHCHD3和SLC25A32通过ELP3诱导表达（图 5B-E）。
通过3C实验和ChIP检测，在ELP3敲除细胞中，ELP3对于SLC25A32和CHCHD3这两个基因的启动子和增强子的关联是不可或缺的（图 5F-G）。这表明ELP3对RB1CC1刺激铁死亡相关的转录重编程至关重要。细胞共定位和细胞死亡实验结果表明，RB1CC1和ELP3依赖C端相互作用，对于使肿瘤细胞对铁死亡敏感至关重要（图 5H-J）。
图5 ELP3对于RB1CC1介导的铁死亡相关转录重编程至关重要
6、激活JNK刺激RB1CC1使铁死亡敏感并抑制肿瘤发生
使用FDA批准的药物库（Sel-leckchem）处理对铁死亡的敏感性低的A549细胞，确定了PTX、Cllolar、OXA和TMZ这四种可协同诱导RB1CC1核易位的药物（图 6A-D）。这四种药物均可磷酸化和激活JNK，使用JNK抑制剂可阻止JNK和RB1CC1的磷酸化，而RB1CC1的磷酸化对其核易位至关重要（图 6E-G）。这表明JNK激活物倾向于增强RB1CC1的磷酸化及其核易位。
此外，结果表明JNK抑制剂可减轻RSL3和erastin诱导的MMP、mitoROS的生成和细胞死亡（图 6J）。IKE与PTX、Cllolar、OXA和TMZ共同给药可抑制甚至逆转肿瘤生长（图 6K）。
图6 激活JNK加强了RB1CC1对铁死亡的敏感性作用
7、本研究的临床和转化意义
研究还表明RB1CC1在肺癌队列中也表达上调（图 7A-B）。根据RB1CC1的细胞定位，将肺癌样本分为细胞质亚型、核亚型和质/核亚型，免疫组化分析显示细胞核亚型的4-HNE水平最高（图 7C-E）。大部分检测的肺癌样本为RB1CC1核定位，核定位的原代LUSC细胞对铁死亡的敏感性也较高（图 7F-G）。
作者发现DEN/ccl4在WT和RB1CC1+/-小鼠肝癌模型中诱导肝肿瘤发生的能力相似（图 7H-I）。在RB1CC1+/-小鼠中，IKE对肿瘤生长的抑制作用显著降低，生存结果也受到了影响（图 7J-K）。总之，RB1CC1对于基于铁死亡的抗肿瘤治疗的疗效至关重要。
图7 本研究的临床和转化意义
三、研究结论
本研究确定了RB1CC1是肿瘤细胞中感知铁死亡的关键调节因子，并提出了一种新的铁死亡相关调节信号通路。同时，以RB1CC1为靶点是加强基于铁死亡的肿瘤治疗的一个有希望的前景。
参考文献
Tumour cells are sensitised to ferroptosis via RB1CC1-mediated transcriptional reprogramming. Clinical and Translational Medicine, 2022.
