文献解读|川崎病单细胞免疫图谱研究

近日，Nature communications杂志在线发表了中国科学院上海营养与健康研究所、上海市儿童医院、上海国际人类表型组研究院等关于川崎病外周血单细胞免疫图谱的研究。科研人员开展了免疫球蛋白治疗前后的川崎病和正常儿童的外周血单个核细胞（PBMC）单细胞转录组研究，揭示了川崎病发病和治疗过程中外周免疫细胞及其亚型的动态变化。

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急性川崎病患者外周血单个核细胞的单细胞转录组测序

Single-cell RNA sequencing ofperipheral blood mononuclear cells from acute Kawasaki disease patients

发表杂志：Nature communications（IF：14.919）

发表时间：2021年9月

应用技术：10x Genomics单细胞转录组测序

研究背景

川崎病（Kawasaki disease, KD）是一种急性、全身发热性疾病和儿童血管炎，可导致冠状动脉病变（CALs），该病疾病主要影响5岁以下的儿童。KD的病因尚不清楚，其诊断仍依赖于主要的临床特征，由于KD的症状和体征类似于其他儿童发热性疾病，迅速诊断KD仍然具有挑战性。在过去的50年里，引发这种疾病的病原体仍然存在广泛的争论。尽管病因尚不明确，但免疫系统的激活为其发病机制提供了重要证据。

 

本研究中，利用10x Genomics单细胞测序分析急性KD患者外周血单个核细胞（PBMCs）。发现单核细胞是炎症介质的主要来源，并且可能是治疗靶点。血浆细胞和效应记忆CD8+ T细胞也参与到KD中，其在静脉注射免疫球蛋白（IVIG）治疗后具有B细胞受体（BCRs）和T细胞受体（TCRs）的克隆扩增。研究结果表明，在KD的发病机制和治疗中，每个细胞类型都有独特的全局和动态免疫应答。

主要结果

1. PBMCs的单细胞转录组测序

本研究收集了7例急性KD患者的14份新鲜外周血样本。对于每个患者，在IVIG治疗前，发烧后第5天采集第一份血样，第二个样本是在IVIG治疗结束并退烧后24小时获得。所有患者对IVIG治疗有反应，均未发生冠状动脉病变（CALS）。此外，本研究还收集了3名年龄匹配的健康献血者的新鲜外周血样本作为对照。

利用10x Genomics单细胞免疫组库技术，进行单细胞RNA、BCR以及TCR测序，分别获得细胞数量为84,986、23,044以及48,456。对细胞进行亚群聚类，并利用SingleR以及Marker基因注释亚群，主要细胞类型包括T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、B细胞、单核细胞、髓样树突状细胞、浆状树突细胞和造血干细胞。与健康对照组相比，治疗前KD患者单核细胞和B细胞比例增加，而T细胞和NK细胞比例减少，该结果与先前报道一致。

单细胞测序分群图

2. 主要PBMC免疫细胞类型的动态

本研究比较了KD患者在IVIG治疗前后每种免疫细胞类型的比例，以及健康对照组在个体水平上的变化。同时对另外16名KD患者和20名年龄匹配的健康供体的外周血淋巴细胞进行了流式细胞分析。单细胞转录组测序数据显示，与治疗后相比，KD患者治疗前B细胞比例增加（P = 0.02，双侧t检验），CD4+ T细胞比例减少（P = 0.01，双侧t检验）。这些结果与之前的大多数研究相似，并且可以通过流式细胞分析证实。与健康对照组相比，KD患者治疗前B细胞比例明显增加（P = 5.28 x 10-6，双侧t检验），治疗后B细胞比例迅速恢复正常。scRNA-seq数据也表明，与健康对照组相比，KD患者的CD8+ T细胞比例更低（P = 0.02，双侧t检验），这与之前的报道以及流式细胞结果再次一致（P = 2.68 x 10-3，双侧t检验）。先前报道表明急性KD患者的NK细胞减少，这通过本研究流式细胞实验得到验证（P = 0.04，双侧t检验）。

不同条件下主要细胞类型的比较

3. 单核细胞亚群和反应

IVIG治疗后，患者的CD16+单核细胞比例明显降低（P = 0.02，双侧t检验），但治疗后KD患者的CD16+单核细胞比例仍然显著低于健康对照组(P = 1.96 x 10-3，双侧t检验)，但没有发现治疗前KD患者与健康对照组之间的显著差异。

为了鉴定更多参与免疫应答的基因，本研究对细胞类型进行差异表达分析。在所有PBMC群体中，最多的差异表达基因（DEGs，FDR ＜0.05）来自于单核细胞。GO和Pathway分析表明，这些DEGs主要富集在S100蛋白、免疫球蛋白受体、细胞因子受体、补体和受体以及MHC II类受体（FDR ＜0.05）。S100A8、S100A9和S100A12主要由中性粒细胞和单核细胞表达，在一系列疾病中发挥促炎功能。与先前研究结果一致，与治疗后和健康对照相比，这些基因在治疗前显著过表达。同样，大多数编码免疫球蛋白受体的DEGs在治疗前KD患者中过表达，包括FCGR3A、FCGR3B、FCGR2A、FCGR2B、FCGR1B和FCEG1G。值得注意的是，尽管FCGR2B被认为是免疫复合物驱动反应中的抑制性受体，但本研究结果与之前的一项研究一致，即在IVIG治疗后，单核细胞中FCGR2B的表达减少。此外，我们发现大多数补体和受体的DEGs在治疗前上调，包括C1QA、C1QB、C1QC、C2、CFD、C3AR1 和C5AR1。与健康对照组相比，无论是否治疗，KD患者中大多数编码MHC II类受体的DEGs均下调，包括HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLADPB1、HLA-DMA、HLA-DMB和HLA-DOA。编码细胞因子和趋化因子受体的DEGs表达模式更多样化。其中一些在治疗前患者中过表达，包括IFNAR2、IFNGR2、IL3RA、IL10RB、CX3CR1，其他在治疗后患者或健康对照中过表达，包括IL7R、IL13RA1、IL6ST、CXCR3。

由于高细胞活性血症（Hypercytokinemia）是KD最重要的特征之一，先前报道表明细胞因子在KD中升高，因此本研究追踪了细胞因子的表达情况。IL-1β和TNF是KD发病过程中至关重要的炎症介质，已被用作治疗IVIG耐药患者的靶点。发现IL1B和TNF主要在PBMCs中的单核细胞中表达，并在治疗前KD患者中上调。除了S100基因外，单核细胞也是表达CCL2、CXCL10、CXCL8、HGF、IL15、IL18、RETN、TNFRSF1B的主要来源。

单核细胞的特性和转录模式

4. B细胞亚群和BCR库

我们鉴定了4个不同的B细胞亚群：初始B细胞、记忆B细胞、浆细胞以及初始B细胞和记忆细胞之间的中间细胞。IVIG治疗后与治疗前相比，浆细胞占B细胞总数的比例增加（P = 0.02，双侧t检验）。

尽管在PBMC中，B细胞展示了最少的DEGs，但这些DEGs主要富集在几个功能类别，包括细胞周期过程、干扰素信号通路和S100基因（FDR<0.05）。与治疗后患者相比，许多与细胞周期正相关的DEGs在治疗前患者中上调表达，如CCND2、RRM2、CENPM、NME1、CKS1B和MYC，而与抑制细胞周期相关的DEGs在治疗前患者中下调表达，如BTG2和CDKN1B。这些表达模式与治疗前显著增加的B细胞丰度一致。一些干扰素应答基因在治疗后上调，包括IRF1、STAT1、ITGB7、PARP14和CD38。

本研究分析了单细胞BCR测序数据，以探究急性KD时BCR动态变化。IVIG治疗后，IGHA 和IGHG 的比例显著升高（P = 0.02，双侧t检验），说明B细胞激活导致免疫球蛋白从IgM/IgD向IgG/IgA的同型转换。然后，本研究根据每个患者独特的VDJ序列检测BCR克隆型。有趣的是，除P7外，大多数患者治疗后与治疗前相比， BCRs克隆（克隆≥3）的比例显著增加。在治疗后KD患者中BCRs克隆也显著高于治疗前患者（P = 0.03，双侧t检验）和健康对照组（P = 0.04，双侧t检验）。除P7外，在所有治疗后的患者中，都观察到显著的克隆扩增，主要是IgA和IgG（FDR＜0.01, Fisher精确检验）。

B细胞和BCR的特性

5. T细胞和NK细胞亚群以及TCR库

基于基因表达进一步对CD4+ T、CD8+ T和NK细胞亚群进行精细分群。CD4+ T和CD8+ T细胞均包含三个亚群：初始细胞、中央记忆细胞和效应记忆细胞。记忆CD8+ T细胞也表达高水平的细胞毒性相关基因（GZMK 和GZMB）。此外，还发现调节性CD4+ T细胞、γδ T细胞和增殖T细胞。虽然在急性KD期间，没有观察到CD4+ T细胞亚群的显著变化，但与健康对照组相比，KD患者CD8+ T细胞中初始细胞比例显著增加（P = 0.01，双侧T检验），效应记忆细胞比例显著降低（P = 0.04，双侧T检验）。这些结果表明，效应记忆细胞激活后可获得快速的细胞毒性功能，是导致外周血淋巴细胞中CD8+ T细胞减少的主要亚群。NK细胞包括两个亚群：高表达CD16细胞和高表达CD56细胞。治疗后高表达CD16的NK细胞比例下降（P = 0.03，双侧t检验），这与CD16+单核细胞的趋势相似。

在CD4+和CD8+ T细胞中，许多DEGs与免疫反应和能量代谢相关的表达模式相似。一组常见的DEG在CD4+和CD8+T细胞中的干扰素信号和应答都显著富集（FDR＜0.05）。其中一些DEGs在治疗前上调，如IFNGR2、ITITM2和SOCS3，其他的在治疗后上调，如STAT1、IRF1、GBP1、GBP4和IL10RA。在NK细胞中也观察到不一致的干扰素反应，与B细胞相似，所有这些淋巴细胞群体中S100基因的表达在KD患者中均高于健康对照组。此外，基因集富集分析（GSEA）鉴定到CD4+和CD8+ T细胞中一些标志基因集的显著协调改变（FDR ＜0.05），与治疗后患者和健康对照组相比，治疗前患者的氧化磷酸化和MYC靶点被强烈激活。在CD4+和CD8+ T细胞中，观察到许多MYC靶基因，包括MYC 本身在治疗前的KD患者中显著上调。

利用单细胞TCR测序数据跟踪TCR克隆型。克隆TCRs的T细胞（克隆＞3）在高表达GZMB 的效应记忆CD8+ T细胞中富集，表明该细胞具有很强的细胞溶解活性。与BCR库的动态类似，大多数患者在IVIG治疗后，克隆TCR的比例明显增加（P = 0.04，双侧t检验）。这些结果支持了传统抗原而非超抗原可能是KD发病机制的原因。

T细胞和TCRs的特性

研究结论

本研究使用单细胞RNA测序，分析了7名急性KD患者在静脉注射免疫球蛋白治疗前后的外周血单个核细胞，利用3名年龄匹配的健康样本作为对照。在单核细胞中发现表达差异最大的基因，在急性KD中，促炎介质和免疫球蛋白受体高表达，MHC II类基因低表达。对另外16名KD患者的细胞进行的单细胞RNA测序和流式细胞术分析表明，尽管治疗后总B细胞的比例大幅下降，但B细胞中浆细胞的比例显著增加。与健康对照组比较，急性KD组中CD8+ T细胞比例，尤其是效应记忆CD8+ T降低。治疗后观察到B细胞受体和T细胞受体的克隆扩增。本研究确定了每一种细胞类型变化背后潜在的生物过程。先天和适应性免疫反应的单细胞图谱为KD的发病机制和治疗提供了深刻见解。

参考文献

Wang Z, Xie L, Ding G, et al. Single-cell RNA sequencing of peripheral blood mononuclear cells from acute Kawasaki disease patients.Nat Commun. 2021; 12(1): 5444.

李超   | 文案