项目文章J Hazard Mater(IF 14)| 烟台海岸带
磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯 (TDCIPP)是一种典型的有机磷污染物,在水环境中广泛存在。先前研究表明,TDCIPP通过蛋白磷酸化来发挥多重毒性,但是其中机理尚不明确。
2022年7月15日,国际顶尖环境科学期刊Journal of Hazardous Materials(IF 14.224)在线发表了中科院烟台海岸带研究所吉成龙等老师的创新研究成果“Toxicological effects of tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate in oyster Crassostrea gigas using proteomic and phosphoproteomic analyses”。该研究采用蛋白质组学和磷酸化修饰组学,结合传统方法对不同浓度TDCIPP处理的牡蛎进行毒理效应研究。组学分析显示,TDCIPP通过直接磷酸化关键蛋白或上游信号通路来调节转录、能量代谢、细胞凋亡和增殖,让我们对TDCIPP的毒理机制有了新的认识。中科新生命提供了蛋白质组和磷酸化修饰组检测服务。
研究材料
牡蛎
技术路线
步骤1:TDCIPP生物浓度;
步骤2:消化腺组织学变化;
步骤3:关键酶活性检测;
步骤4:蛋白质组学分析;
步骤5:磷酸化修饰组学分析。
研究结果
1. TDCIPP生物浓度
与对照组相比,5和50 μg/L TDCIPP处理组牡蛎中TDCIPP含量显著积累 (图1)。
图1 不同处理组牡蛎的TDCIPP积累2. 消化腺组织学变化
H&E染色显示对照组消化管腔呈十字形,消化细胞高,管腔窄,消化管上皮厚。TDCIPP处理组的上皮细胞较薄,管腔较宽,消化管管腔由十字形变为圆形,最高浓度(50 μg/L)处理组的消化细胞发生脱落(图2)。
图2 牡蛎消化腺的石蜡切片随着TDCIPP剂量的增加,消化管MLR/MET比值增加,其中50 μg/L TDCIPP处理组的牡蛎样品MLR/MET值最高;5 μg/L TDCIPP处理组次之(图3)。
图3 不同处理组消化腺MLR/MET值3. 关键酶活性检测
CAT和GST活性在对照组和TDCIPP暴露组间无显著差异。AChE的活性呈底部变化。在caspase-9活性方面,只有50 μg/L TDCIPP处理组显著高于对照组。与对照组相比,TDCIPP治疗组caspase-3活性无显著变化(图4)。
图4 TDCIPP暴露后消化腺的酶活性4. 蛋白质组学分析
从牡蛎消化腺样本中共鉴定出6705个蛋白质。与对照组相比,50 μg/L TDCIPP处理组的牡蛎共有551个差异表达的蛋白质(DEPs),其中上调蛋白259个,下调蛋白292个。GO富集分析发现(图5A),大多数DEPs位于细胞内(74),参与代谢过程(147)和细胞过程(114),分子功能主要集中在催化活性(168)和结合活性(131)。KEGG通路分析显示(图5B),上调的注释蛋白在脂类和氨基酸的代谢过程中富集,下调的注释蛋白在三个Hippo信号通路等中富集。其中,谷胱甘肽代谢通路覆盖最多DEPs(8);最显著富集通路是维生素B6代谢;其他富集的KEGG通路与代谢过程有关。
图5 50μg/L TDCIPP处理的消化腺中DEPs的GO富集柱状图(A)和KEGG通路富集气泡图(B)5. 磷酸化修饰组学分析
在牡蛎消化腺中,共鉴定出850个磷酸化蛋白,152个蛋白被差异磷酸化。GO分析显示(图6A),在生物过程中,富集程度最高的是含蛋白复合体和细胞含蛋白复合体。大多数DPPs的分子功能是核酸结合(21)。细胞成分大多位于蛋白质-DNA复合体(3)、DNA包装复合体(3)和核小体(3)中。KEGG通路分析显示(图6B),在MAPK信号通路、病灶黏附和TCA循环中,磷酸化蛋白高度富集。在50 μg/L TDCIPP处理组中,病灶粘连通路覆盖的DPPs最多(5)。最显著富集通路的是丙酮酸代谢。其他的富集通路参与信号转导通路和能量代谢通路。将鉴定的DEPs与DPPs进行比较,发现在两者间并未出现重叠蛋白,但KEGG分析表明,在TDCIPP处理后,DEPs和DPPs都参与了信号通路。
图6 50 μg/L TDCIPP处理的消化腺中DPPs的GO富集柱状图(A)和KEGG通路富集气泡图(B)小编小结
本研究利用蛋白质组学+磷酸化修饰组学,结合生化数据和组织学结果,发现TDCIPP具有刺激性神经毒素,会破坏细胞凋亡与细胞增殖之间的内部稳态。高浓度的TDCIPP可通过直接磷酸化关键蛋白或其上游信号通路导致转录、能量代谢、细胞凋亡和增殖等过程发生异常。