如何鉴定敲除细胞系是否构建成功

常见的CRISPR-Cas9系统，是基于gRNA与目的基因互补配对将其锚定在Cas9蛋白的特定结构域上，RuvC 的结构负责非互补链的切割，切割的位点位于 PAM 的 5’端的第三个碱基 外侧，而中部类似于 HNH 的结构负责互补链的切割，从而实现基因片段的敲除。

常用的CRISPR-Cas9系统电转方法是将 gRNA 和 Cas9 蛋白孵育结合为 RNP，电转到靶细胞中，进行双 sgRNA 片段敲除。或者可采用质粒或病毒转导将双sgRNA与 Cas9 基因构建在同一载体中使其转导入目的基因所在的细胞中，实现片段敲除。

技术原理图

初步鉴定敲除细胞系是否构建成功，需鉴定其DNA水平。片段敲除可有如下的鉴定策略（图1）。设计引物PCR扩增三个区域，分别为gRNA-A1作用的区域（Region 1蓝色框区域,  gRNA-A2作用的区域(Region 2绿色框区域）和敲除区域（Region 3 黑色框区域）。如果gRNA作用的区域无法扩增出条带，而完整的敲除区域扩增出比野生型小的条带，则说明该细胞系在基因组水平上已经实现了敲除。

PCR鉴定位点如下图

（图1：鉴定策略） （片段敲除细胞系的电泳鉴定结果）

Region 1 (WT:643 bp; 杂合子:643 bp; 纯合子: 0 bp)

Region 1 扩增上游gRNA-A1切割位点，靶位点被KO之后不能扩增出条带  

Region 2 (WT:958 bp; 杂合子:958 bp; 纯合子: 0 bp)

Region 2 扩增下游gRNA-A2切割位点，靶位点被KO之后不能扩增出条带  

Region 3 (WT:5577 bp; 杂合子:5577/~637 bp; 纯合子: ~637 bp)

Region 3 扩增包含整个KO的区域，KO后的条带小于WT的条带