生信100-1-FASTQ与FASTA

2023-01-06 本文已影响0人森尼啊

1.1 掌握FASTQ格式

格式有什么特点？
第1行什么开头，主要内容都有哪些？
第2行是什么？
第3行是什么？
第4行是什么？
什么是phred值，怎么计算？
phred33 与 phred64是什么意思？

1.2 FASTA格式的构成是怎样的，有什么样的规律？

1.3 什么序列适合用FASTA保存，什么序列适合用FASTQ保存？

参考https://luohao-brian.gitbooks.io/gene_sequencing_book/content/di-2-8282-fasta-he-fastq.html

1.1 FASTQ-测序的图像数据转换过来

组成：

第一行：以‘@’开头，是这一条read的名字，这个字符串是根据测序时的状态信息转换过来的，中间不会有空格，它是每一条read的唯一标识符，同一份FASTQ文件中不会重复出现，甚至不同的FASTQ文件里也不会有重复；
第二行：测序read的序列，由A，C，G，T和N这五种字母构成，这也是我们真正关心的DNA序列，N代表的是测序时那些无法被识别出来的碱基；
第三行：以‘+’开头，在旧版的FASTQ文件中会直接重复第一行的信息，但现在一般什么也不加（节省存储空间）；
第四行：测序read的质量值，这个和第二行的碱基信息一样重要，它描述的是每个测序碱基的可靠程度，用ASCII码表示。

@DJB775P1:248:D0MDGACXX:7:1202:12362:49613 TGCTTACTCTGCGTTGATACCACTGCTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA

+

JJJJJIIJJJJJJHIHHHGHFFFFFFCEEEEEDBD?DDDDDDBDDDABDDCA @DJB775P1:248:D0MDGACXX:7:1202:12782:49716 CTCTGCGTTGATACCACTGCTTACTCTGCGTTGATACCACTGCTTAGATCGG

+

IIIIIIIIIIIIIIIHHHHHHFFFFFFEECCCCBCECCCCCCCCCCCCCCCC

phred值

Q = -10log(p_error)

p_error是碱基的测序错误率，p_error的值和测序时的多个因素有关，体现为测序图像数据点的清晰程度，并由测序过程中的base calling 算法计算出来
Q即Phred quality score

image

为什么要用ASCII码来代表，直接用数字不行吗？

行！但不美观。为了格式存储以及处理时的方便，这个数字被直接转换成了ASCII码，并与第二行的read序列构成一一对应的关系——每一个ASCII码都和它正上面的碱基对应，这就很完美。

不过，值得一提的是，所有小于33的ASCII码值所表示的都是不可见字符，比如空格，换行符等，因此为了能够让碱基的质量值表达出来，必须避开所有这些不可见字符。最简单的做法就是加上一个固定的整数！也的确是这么干的。

但一开始对于要加哪一个整数，并没有什么指导标准，这就导致了在刚开始的时候，不同的测序平台加的整数也不同，总的来说有以下3种质量体系，演变到现在也基本只剩下第一种了，如下表：

image

现在一般都是使用Phred33这个体系，而且33也恰好是ASCII的第一个可见字符（'!'）。

#!/bin/bash
less $1 | head -n 1000 | awk '{if(NR%4==0) printf("%s",$0);}' \
| od -A n -t u1 -v \
| awk 'BEGIN{min=100;max=0;} \
  {for(i=1;i<=NF;i++) {if($i>max) max=$i; if($i<min) min=$i;}}END \
  {if(max<=126 && min<59) print "Phred33"; \
  else if(max>73 && min>=64) print "Phred64"; \
  else if(min>=59 && min<64 && max>73) print "Solexa64"; \
  else print "Unknown score encoding"; \
  print "( " min ", " max, ")";}'

1.2 FASTA -有顺序

两部分组成:

序列头信息（有时包括一些其它的描述信息）和具体的序列数据头信息独占一行，以大于号（>）开头作为识别标记，其中除了记录该条序列的名字之外，有时候还会接上其它的信息。
紧接的下一行是具体的序列内容

特点

FASTA的头信息并没有被严格地限制，用一个空格把头信息分为两个部分，很多生信软件（如：BWA，samtools，bcftools，bedtools等）都是将第一个空格前面的内容认定为序列名字来进行操作的
FASTA由于是文本文件，它里面的内容是否有重复是无法自检

>ENSMUSG00000020122|ENSMUST00000138518 CCCTCCTATCATGCTGTCAGTGTATCTCTAAATAGCACTCTCAACCCCCGTGAACTTGGT TATTAAAAACATGCCCAAAGTCTGGGAGCCAGGGCTGCAGGGAAATACCACAGCCTCAGT TCATCAAAACAGTTCATTGCCCAAAATGTTCTCAGCTGCAGCTTTCATGAGGTAACTCCA GGGCCCACCTGTTCTCTGGT
>ENSMUSG00000020122|ENSMUST00000125984 GAGTCAGGTTGAAGCTGCCCTGAACACTACAGAGAAGAGAGGCCTTGGTGTCCTGTTGTC TCCAGAACCCCAATATGTCTTGTGAAGGGCACACAACCCCTCAAAGGGGTGTCACTTCTT CTGATCACTTTTGTTACTGTTTACTAACTGATCCTATGAATCACTGTGTCTTCTCAGAGG CCGTGAACCACGTCTGCAAT

生信100-1-FASTQ与FASTA

1.1 FASTQ-测序的图像数据转换过来

phred值

1.2 FASTA -有顺序

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