10+单细胞生信文章，探索肿瘤微环境在免疫治疗前后及不同疗效之间

生信小课堂

影响因子：12.3

研究概述：

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌病例的85%。通过免疫检查点阻断（ICB）进行癌症免疫治疗是没有已识别的驱动基因突变的高级NSCLC的一线治疗，但大多数患者对免疫疗法或获得耐药性，其潜在机制仍有待探索。作者进行了3名治疗前和12名治疗后非小细胞肺癌（NSCLC）患者的约92,000个单细胞的转录组，这些患者接受了新辅助PD-1阻断和化疗，治疗后样本根据病理反应分为两组：主要病理反应（MPR；n = 4）和非MPR（NMPR；n = 8）。作者发现独特的治疗诱导的癌细胞转录组与临床反应有关，揭示了免疫治疗期间中性粒细胞的异质性，并确定MPR患者中老年CCL3+中性粒细胞子集有所减少。预计老化的CCL3+中性粒细胞会通过正反馈回路与SPP1+ TAM相互作用，导致治疗反应不佳。新辅助PD-1阻断与化疗相结合，导致与治疗反应相关的不同NSCLC肿瘤微环境转录组。尽管受联合治疗的患者样本量受到限制，但这项研究提供了新的生物标志物来预测治疗反应，并提出了克服免疫治疗耐药性的潜在策略。

本文本质上是分析不同组别的肿瘤微环境（疾病微环境）的差别。对应到我们自己的研究中，可用于疾病vs正常，处理组vs对照组等等。值得借鉴！需要做类似的生信分析欢迎交流！

研究结果：

一、PD1阻断期间NSCLC结合化疗的scRNA-seq分析

1.从15名患者的单细胞测序中收集了15个肿瘤样本，从21名患者中收集了21个治疗前肿瘤样本，用于普通转录组测序（图1A）。所有细胞降维聚类确定了26个聚类（图1B），在不同患者没有观察到明显的批次效应。根据相应的典型标记基因的表达，将26个簇注释成T细胞、NK细胞、B细胞、骨髓细胞、中性粒细胞、浆细胞、浆细胞质细胞DC（pDC）、肥大细胞、基质细胞（纤维细胞/内皮细胞）和上皮细胞（图1B）。

2.作者计算了TN（Treatment-naïve）、MPR和NMPR患者中不同细胞类型的分数（图1C，D）。MPR患者的T细胞、NK细胞和B细胞的比例有所增加，由于样本量有限，没有获得阳性P值（图1D）。作者在10个治疗后手术肿瘤组织（3个MPR和7个NMPR，对应scRNA-seq样本）和另外5个未治疗的手术肿瘤组织中进行了免疫组织化学（IHC）染色。IHC染色验证了MPR样本中T（CD3+）和B（CD20+）细胞丰度的增加，但NK（CD56+）细胞除外（图1E、F）。这与之前的报告一致，即T和B细胞扩张与对ICB的更好反应有关。TME的髓细胞富集，但在TN、MPR和NMPR患者之间没有明显差异（图1D）。

二、联合治疗后pCR患者正常肺上皮细胞的增加和残留癌细胞的检测

1.首先将上皮细胞重新聚类为10个种群，并根据拷贝数变化（CNVs）分离恶性和正常细胞（图2A、B）。集群E0_DST、E3_PCNA、E4_TOP2A、E7_SERPINB9和E1_KRT17的亚群的CNV评分高于其他集群，并被推断为恶性细胞（图2B）。正常簇被注释为肺泡细胞，纤毛细胞，基于传统标记的基底上皮细胞（图2A，B）。治疗后，特别是MPR患者中，肺泡细胞（E5_SFTPA2）、球杆细胞（E8_SCGB1A1）和纤毛细胞（E9_TPPP3）的分数增加。这表明，联合治疗在消除恶性细胞后促进了正常上皮细胞的扩张。正常的上皮细胞可能有助于重建前一个肿瘤床的正常肺结构。

三、恶性细胞的独特分子特征区分了MPR和NMPR

1.在TN、MPR和NMPR患者中进行了差异表达分析。MPR患者的恶性细胞高度表达了CX3CL1、CD74和主要组织相容性复合物II类（MHC-II）基因（图2C）。Aldo-Keto还原酶家族（AKR1B1/10和AKR1C1-3）中的酶在NMPR患者的癌细胞中高度表达（图2D）。基因集变异分析（GSVA）显示，在联合治疗后，NMPR患者的恶性细胞中雌激素反应途径被上调（图2E）。数据表明，治疗后NMPR患者的雌激素代谢可能异常高。

2.使用非靶向代谢组学来检测基线（新辅助治疗前）、治疗（第一或第二周期，每周期3周，共2-4周期）和治疗后（最后一次给药后4周，手术前收集血液样本）中10名MPR（30%女性）和14名NMPR（7%女性）患者（图2F）。与治疗期间的基线相比，NMPR患者的β-雌二醇水平显著升高（图2G）。当将患者从scRNA-seq队列中移除时，结果相似。血清中雌激素水平升高可能反映了对免疫治疗反应不佳。

3.作者探索了NSCLC细胞系的数据，发现NMPR特征与17-AAG（一种HSP90的抑制剂）的IC50（最大抑制浓度的一半）呈负相关（图2H），表明NMPR患者的癌细胞可能对17-AAG敏感。据报道，17-AAG通过破坏HSP90来抑制雌激素信号传导。

四、联合治疗后抑制性Tregs的细胞毒性T/NK细胞扩张和减少的程度与病理反应呈正相关

1.由于T细胞是TME中肿瘤浸润最丰富的淋巴细胞，作者重新聚集了T/NK细胞，并确定了14个集群（图3A、B）。治疗后，细胞毒性和耗竭细胞特征都显著增加（图3C，D）。这相当于治疗后所有CD8+ T簇的派系增加（图3E）。相对于TN患者，治疗后样本中Tem（CD8_GZMK）和Trm（CD8_GZMB）以及循环效应T细胞（CD8_STMN1）的分数增加，在MPR患者中增加更明显（图3E）。

2.集群NK_FCGR3A是细胞毒性细胞最具代表性的细胞，通过FCGR3A（CD16a）、FGFBP2和CX3CR1的表达与NK_KLRD1细胞区分开来（图3B）.鉴于CX3CL1在MPR患者癌细胞中的表达（图2C），NK_FCGR3A细胞可能被CX3CL1招募到TME中。细胞-细胞相互作用分析显示，癌细胞和NK_FCGR3A细胞之间的CX3CL1-CX3CR1相互作用在MPR患者中显著丰富（图3F）。

3.与TN患者相比，MPR和NMPR患者的原始Tregs（Treg_SELL，表示SELL和LEF1）的比例都有所下降（图3E）。MPR患者始终显示Treg耗竭的特征低于NMPR患者（图3G）。

五、治疗促进记忆T细胞分化为效应表型

1.联合治疗后，记忆CD8+ T细胞（CD8_IL7R）减少，而效应T细胞增加（图3E）。这表明，治疗可能会直接诱导记忆T细胞激活成细胞毒性表型。作者进行了轨迹分析，从Tem（CD8_GZMK）到Trm（CD8_GZMB）到Tex细胞监测到一个过渡路径（CD8_HAVCR2；图3H）。

2.划定CD8_IL7R细胞的分布时，作者注意到CD8_IL7R细胞可以分为2个阶段（图3I）。CD8_IL7R细胞在静止阶段高度表达NR4A1-3，而细胞毒性相关基因（GZMA、NKG7和CCL5）和MHC-II基因（CD74和HLA-DRA）在激活阶段被上调，治疗后激活细胞的比例增加，MPR中激活的CD8_IL7R细胞比NMPR样本多（图3I）。

六、FCRL4+FCRL5+记忆B细胞预测对ICB的反应，并通过激活CD4+ T细胞来促进免疫治疗

1.作者将B细胞重新聚类为7个亚群（图4A）。记忆B细胞在联合治疗后普遍减少，但FCRL4+FCRL5+ B细胞（B4_FCRL4），定义为“非典型记忆B细胞”，在MPR患者中表现出略有增加的趋势（图4B）。免疫荧光染色表明，FCRL4+FCRL5+细胞的MPR比NMPR样本更丰富，CD20+ B单元格聚合在TLS和FCRL4+FCRL5+ B单元格中，位于TLS的中心（图4D）。

2.在ICB联合化疗之前，MPR患者的标记得分明显更高（图4E）。对两个独立的黑色素瘤队列的已发布数据集进行了类似的分析。B4_FCRL4特征在预测免疫治疗反应方面也表现良好。在两个队列中，在治疗前后，B4_FCRL4的标记（完全反应或部分反应）高于非反应者（稳定疾病或进行性疾病）（图4F）。较高的B4_FCRL4特征与之前发表的“黑色素瘤队列2”的生存率提高有关（图4G）。

3.作者预测了驱动靶细胞转录组变化的配体。FCRL4+ FCRL5+ B细胞可以通过配体-受体对与Tfhs相互作用：CXCL13-CXCR5、CD40-CD40LG和CD28-CD86.Tfhs和CD8+ T细胞之间的IL21-IL21R相互作用显著丰富（图4H）。

七、CX3CL1招募了单核细胞，并预测免疫治疗反应

1.TME中的髓样成分表现出显著的异质性，因此根据典型标记基因被分为11个簇，包括2个单核细胞亚型、6个巨噬细胞亚型和3个DC亚型（图5A）。Mono_CX3CR1高表达单核细胞标记（FCN1、VCAN、S100A8和S100A9）、原始标记（SELL）和较低的MHC-II分子（图5B，C），代表“原始”的状态。Mono_VEGFA的单核细胞标记表达较低，巨噬细胞标记（MRC1、CD163和MSR1）和MCH-II分子的表达较低，这表明存在“前巨噬细胞”状态（图5B，C）。轨迹分析证实，Mono_VEGFA是原始单核细胞和巨噬细胞之间的中间表型（图5D）。Mono_VEGFA高度表达的VEGFA，一种促血管生成因子，反映了免疫抑制表型（图5B，C）。MPR患者的Mono_VEGFA细胞减少（图5E），VEGFA的表达在MPR患者中受到下调。

2.Mono_CX3CR1细胞在MPR患者中的丰度增加（图5E）。Mono_CX3CR1细胞也表达了高CFP（图5C）。CFP的表达与TCGA-LUAD患者的凋亡特征显著相关，MPR患者的Mono_CX3CR1细胞的CFP表达明显高于TN和NMPR患者（图5F，G）。

3.使用普通转录组测序数据预测ICB反应。在验证队列中的MPR患者和两个独立黑色素瘤队列的响应者中观察到更高的Mono_CX3CR1特征（图5H，I）。较高的Mono_CX3CR1特征与黑色素瘤数据集2的存活率提高有关（图5J）。细胞-细胞相互作用分析显示，CX3CL1-CX3CR1对在Mono_CX3CR1细胞和MPR患者的癌细胞之间显著富集（图5K）.

七、联合治疗扩大了组织常驻巨噬细胞，将TAM重新编程为M0表型，并抑制了MPR患者的免疫抑制功能

1.Macro_FABP4细胞是组织常驻肺泡巨噬细胞（AM），具有典型AM标记（FABP4、MCEMP1和MARCO；图5B）。与其组织修复功能一致，Macro_FABP4 AM尽管在MPR患者中程度更高，治疗后患者中也显著升高（图6A）。

2.治疗后，M2样Macro_SPP1巨噬细胞减少，而Macro_SELENOP巨噬细胞在NMPR患者中呈上升趋势（图6A）。巨噬细胞分为三种亚型：M0（非极化或中性）、M1（促炎或抗肿瘤）或M2（抗炎或促肿瘤）。计算了M0、M1和M2标记评分，AM表现出类似M0的表型，Macro_SPP1、Macro_SELENOP和Macro_C1QA都具有更强的M2特征，只有Macro_CXCL9单元格显示高M1特征（图6B）。谱系追踪分析发现单核细胞的两条分化路径，一条路径通向类似M1的Macro_CXCL9单元格，另一条路径分化为类似M2的Macro_SELENOP和Macro_SPP1单元（图5D）。

3.在MPR患者中，巨噬细胞的M2特征减少了。M1特征和M1样子集（Macro_CXCL9）在MPR患者中都没有表现出增加的趋势，甚至在治疗后也有所下降（图6A，C）。与TN患者相比，MPR患者的M0特征增加了（图6C）。

八、树突状细胞通过治疗被激活，并在MPR患者中扩张

DC分为3种子类型，包括传统的I型DC（cDC1，DC_XCR1），传统的II型DC（cDC2，DC_CD1C），以及最近描述的LAMP3+ DC（DC_LAMP3）（图6D）.轨迹分析表明，mregDCs可能同时由cDC1s和cDC2s生成（图6E）。联合治疗后，MPR患者的cDC1s和cDC2s的分数增加（图6A）。此外，治疗后，DCs的抗原呈递标记显著增加，特别是对于MPR患者（图6F），表明DCs在治疗后被激活。DC_CD1C细胞表达了CX3CR1（图6D），DC_CD1C细胞和MPR患者的癌细胞之间的CX3CL1-CX3CR1相互作用显著丰富（图6G）。

九、MPR患者的老年中性粒细胞减少，并通过CCL3和CCL4招募SPP1+ TAM

1.中性粒细胞分为4个子集群，包括2个成熟子集（CD16+CXCR2highCXCR4low；Neu_S100A12和Neu_OSM）和2个老化子集（CD16+CXCR2lowCXCR4high；Neu_CCL3和Neu_IFIT3）（图7A，B）.Neu_S100A12子集群是轨迹的根，Neu_CCL3和Neu_IFIT3子集群是端点状态（图7C）。沿着这个轨迹，CXCR2的表达减少了，而CXCR4在伪时间增加了（图7D）。血清CXCL8是免疫治疗结果不佳的强预测因素，与MPR中Neu_CCL3细胞中CXCL8的表达低于TN和NMPR患者有关（图7E）。Neu_IFIT3细胞表达干扰素刺激基因（IFIT1-3、RSAD2和MX1）。免疫检查点（CD274和IDO1）在老年集群中上调（图7B），反映了免疫调节表型。作者发现ELANE（弹性酶）基因的表达，它在所有中性粒细胞中都是阴性的（图7B）。据报道，该基因在人类中性粒细胞中具有抗癌功能。

2.在所有老化的中性粒细胞子簇中，Neu_CCL3细胞在MPR患者中耗尽最多（图7F），表示TME中的抑制表型。

3.NicheNet分析预测，SPP1、IFNγ和IL1B配体驱动老化Neu_CCL3细胞的特定表型（图7G）.SPP1-CD44和IL1B-ADRB2对在两种细胞类型中显著富集，预计由老化的Neu_CCL3细胞分泌的CCL3和CCL4将由CCL3-CCR1、CCL3-CCR5和CCL4-CCR5对招募Macro_SPP1巨噬细胞（图7H）。在TCGA-LUAD患者中，Neu_CCL3特征与Macro_SPP1特征显著相关（图7I）。Macro_SPP1巨噬细胞参与生产老化的Neu_CCL3中性粒细胞，而老化的Neu_CCL3中性粒细胞反过来招募Macro_SPP1巨噬细胞（图7J）。缺乏Neu_CCL3-Macro_SPP1相互作用可能导致MPR患者Macro_SPP1巨噬细胞和Neu_CCL3中性粒细胞的减少（图6A和7F）。

研究总结：在这项研究中，作者检查了PD-1阻断和化疗联合治疗前后可切除的NSCLC的单细胞转录组，并分析了整个TME的病理反应，以调查免疫系统和癌症治疗反应（图8）。可切除NSCLC的scRNA-seq分析揭示了新佐剂ICB结合化疗前后TME的动态，以及良好响应者和不良响应者之间独特的TME特性。作者在TME中确定了血清雌二醇和两种细胞类型（FCRL4+FCRL5+记忆B细胞和CD16+CX3CR1+单核细胞），它们可以作为治疗反应的生物标志物。此外，本研究捕获了高比例的中性粒细胞，揭示了免疫治疗期间的巨大异质性。该数据集将成为癌症和中性粒细胞生物学的宝贵持续资源。