数字PCR（二）— Bio-rad ddPCR

1.数字PCR优势

数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测；此外，由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变

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• 终点检测
• 无需标准曲线的绝对定量
• 对PCR扩增效率不敏感
• 对PCR抑制剂耐受程度高

2.Bio-rad QX200介绍

2.1 系统组成

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2.2. 操作流程

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2.2.1. 反应液准备及芯片加载

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• 微滴生成仪为压力装置，每条微滴发生卡可以做8个样本，每次进行ddPCR实验，样本需为8的倍数，不够的样本数，以NTC补齐
• 到检测样本在转移至微滴发生卡前，需要充分混匀，且需要避免产生气泡
• 转移样本至微滴发生卡过程中，可悬空加液，避免产生气泡，如有气泡，需用干净枪头扎破
• 加微滴生成油过程中，应注意加液手法保持一致，进而使得后续微滴生成过程中，每孔压力相同
• 从微滴发生卡中转移微滴时，需控制移液速度，尽可能将微滴全部转移（该步骤可以将移液器量程预调至42μl，转移微滴时控制手速，在吸取即将完成时停顿3-5s，使微滴能上浮至枪头上部，如果未能吸取完成，可以调大量程移液，该步骤如果操作不当，微滴损失较大）
• 微滴生成油易挥发，在微滴转移至96孔板后，应及时使用锡箔纸盖住
• 将微滴转移至96孔板时，尽可能一次移液，一次性打完，避免二次移液造成的污染

2.2.2 微滴生成

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• 微滴发生卡座底部为磁性材料，在转移过程中，避免与桌面摩擦产生静电，该过程会影响后续微滴生成仪的正常运行
• 微滴生成仪在使用之前，可以使用75%酒精将内部擦拭，浮尘可能会在微滴的生成过程中，堵塞微滴发生卡

2.2.3. PCR反应后微滴读取

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• 每个微滴经过双通道检测（FAM，VIC/HEX）
• 检测速度约为32孔/小时

2.2.4. 微滴读取仪器常见问题

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• 更换微滴读取油时，需进行Flush system次，primer两次
• 如瓶灯显示异常，可能是由于废弃油桶已满，或者读取油体积不够，如果这两者都不是，则可能是由于油桶侧壁上有油滴，此时会让液面传感器检测出错
• 将96孔板放入微滴读取仪时，需小心操作，并检查是否固定牢固，否则可能会损坏仓门
• 微滴读取仪的仓门开关按下后，如果无法自动开启，请重启后再次尝试
• 读取仪探针孔，需要定期使用75%酒精进行清洗

2.2.5. 数据解读

2.2.5.1 一维图（1D）

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2.2.5.2 二维图（2D）

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2.2.5.3 数据分析原理

• 阳性微滴比例p

  
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• 上样量（拷贝数）与阳性微滴占比

  
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• Copies per droplet = -ln（1-p）， p = fraction of positive droplets
• 仪器统计阴阳性微滴数，并计算阳性微滴的占比，根据泊松分布对其进行修正，计算出每个微滴中所含有的阳性拷贝数，根据理论微滴总数（每个微滴体积默认为1nl，20ul体系中微滴总数为20000个）即可计算出阳性的总拷贝数，其原理就是对理论值为20000的微滴总体中进行抽样，根据经验，如果检测到的实际微滴总数超过10000，则我们认为数据可靠，可以用于计算CPD（copies per droplet），如果微滴总数小于10000，则实验数据不可靠，需要重复测试，一般熟练操作者，可保证微滴总数在17000以上
• 系统的检测范围在1~100000copies/20μl（数字PCR的原理是基于泊松分布，所以整个体系中必须要有阴性微滴存在，而根据上图图，总上样量超过100000copies时，系统中无阴性微滴存在，无法根据泊松分布进行修正），一般情况下，样本上样总量不超过20000copies/20μl
• 文献报道的ddPCR方法的检测限一般为0.1%，当然在提高上样量的前提下，可以将检测下限降至更低，但是通常样本很珍贵，我们无法投入太多的样本。
• 在上样量较高的情况下，5copies/20μl的检测数据也是可靠的

3.数字PCR应用类型

3.1 稀有突变检测Rare Event Detection

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• 如使用Taqman MGB探针检测SNP，单孔检测过程中必须存在竞争型探针，如Mu/Wt探针共存于一孔，否则检测效果极差
• 数字PCR可以显著提高检测的灵敏度，这在RED实验中占有极大的优势

3.2 拷贝数变异

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4.Tips

4.1 Q：样本上样量方面：在保证实验有效性的前提下，样本最低上样量是多少？

A：最低微滴上样量是和您的实验的突变比例灵敏度需求相关的，人类cfDNA的具体上样需求，可见下表

LoD	Total copies to screen	Diploid cells	Amount of DNA to screen	Volume of plasma sample*	# of wells
1 in 1,000	3,000	1,500	0,010ug	0.2ml	1
1 in 10,000	30,000	15,000	0.10ug	2ml	1
1 in 25,000	75,000	37,500	0.25ug	5ml	1
1 in 100,000	300,000	150,000	1.0ug	20ml	4
1 in 1,000,000	3,000,000	1,500,000	10ug	200ml	40

4.2 Q：20000个微滴要求有阴性微滴，最佳上样量是？

A：按照泊松分布原理，小于等于5 copies/droplet（100000copies/20ul）的核酸浓度，都能保证总体内有空余微滴存在，通过统计学换算，都可以保证结果稳定，并非必须要求每个微滴单拷贝。20,000个微滴对应的是100,000个拷贝的核酸。即使总微滴数有损失，一般15,000个微滴对应的检测上限也应该是75,000个拷贝。
理论上讲只要有还有1个阴性微滴，ddPCR基于Possion分布都能计算出样本的含量，但是CV%会非常大。可以接受的动态范围是CV%<5%的样本含量范围。对于任何dPCR平台，最佳样本浓度都是λ=0.16时对应的浓度，这个时候CV%是最小的（~1.5%），对应就是最佳上样量了。不过在实际测试中，样本浓度在平台要求的动态范围之内都是OK 的
对于20000个微滴，样本浓度的上限（理论上λ=5.5），对应的阳性微滴比例为99.6%，阴性微滴的比例为0.4%，对应阴性微滴的数量是80个。也就是阴性微滴数超过80个是OK的。其实理论上还可以更少，但是考虑到其他不确定度，这个数比较接近实测结果

4.3 Q：数字PCR产生微滴低于9000这个实验有效性技术方面是怎么考量的？

答：微滴数量低于9000个，从统计学角度来说，抽样量太少，无法使用泊松分布校正，尤其对于高浓度样本来说，定量误差会比较大，检测上限也会降低。如果存在复孔，由于复孔间所有微滴都是独立反应体系，所以可以合并分析复孔数据，将多孔视作一孔。
对于QX200系统来说，如果反应体积是20微升，那么生成的微滴数在20000个左右。实际检测少于20000个，往往来源于系统的死体积、微滴转移时的损失及其他不确定因素。也就是说，微滴制备后，靶标核酸已经随机分布在20000个微滴中，阳性微滴的百分比已经确立，那么后续分析的微滴数量不到20000个，对定量的结果也是无影响的（浓度适合的样本）。实际上我们也遇到过，相同的样本，不同的批次检测，总微滴的数量从4000-20000不等，但是定量的结果无差别。注意，以上的说法前提是“浓度合适的样本”，如果样本浓度太高和太低时，分析的总微滴数偏少，会增加又一个环节的subsampling error,定量的准确性和精度就会受影响了。所以为什么定义8000个微滴，一方面是基于质控的角度。未达到这么多微滴，肯定是有问题的，建议重做；另一方面，对于浓度超高或超低的样本，8000个微滴带来的误差仍小于样本本身取样误差带来影响。

4.4 Q：影响微滴生成数量主要有哪些因素？血液样本中哪些物质会干扰微滴生成的稳定性

A：样本中的蛋白、有机溶剂、表面活性剂、高粘度物质，生成微滴时的环境温度，PCR时的等因素会影响微滴数量。血液样本中主要判断为蛋白残留以及提取过程中没有除尽的酒精。

4.5 Q：微滴生成对引物探针或样本的buffer的离子浓度或PH值是否有要求？

答：引物探针一般都是用水或TE溶解，且在整个20微升反应体系内占比很少，所以对最终反应体系的离子强度或pH影响极低。且ddPCR反应预混合本身就是缓冲液，能维持相对稳定的pH。样本一般也是TE或纯水洗脱，如果提取没有问题的话那对体系也基本没有影响，唯一可能的情况是极高的盐离子浓度提高了微滴渗透压影响了内外相平衡，但一般人血为等渗溶液，不会有这么高的盐浓度，除非提取试剂盒有问题，过柱浓缩时洗不掉样品中过高的离子浓度。相比样本中的蛋白、有机溶剂、表面活性剂、高粘度物质来讲，离子对微滴的影响微乎其微。

4.6 Q：微滴稳定性判定指标是什么？

A：最终测得有效微滴数量超过10,000个，1维图中微滴高度没有出现阶梯式排布，即可认为微滴稳定。

4.7 Q：ddPCR如何判断整个实验是无效的或者是失败的，如果整个反应体系配制没有任何错误？假如实验是无效的，如何补救？

A：ddPCR实验有效性需要分几个方面区分：

• 微滴可靠性：如微滴数量是否足够，是否出现严重“下雨”现象，是否出现阶梯形1D图，阴阳性微滴是否可以明显区分。
• 实验质控：NTC和阴性对照是否出现假阳性，假阳性率是否在可接受的水平；阳性对照的PCR结果是否正常，IPC/野生型序列是否有扩增。
  避免随机出现的无效实验的最佳方式是对每个样本进行技术重复，小概率随机事件不会同时在同一个样本中发生数次。同时，技术重复间还能通过merge的方式，避免微滴数量不足10,000个对您实验造成影响，同时提高数据精度。
• 微滴扩增方面
  Q：使用普通PCR（不可以设爬坡温度）是否影响assay的灵敏度？
  A：一般无法设置Ramp Rate的PCR仪，尤其是老式PCR仪升降温速度都低于3℃/s，不会对微滴造成影响。
  原理：PCR过程中的ramp rate必须调到2.5℃/s以下，其目的是保证每个微滴的PCR扩增效率。因为ddPCR的微滴在PCR时会呈现胶囊状的状态，不能自由对流，因此PCR管中底部的微滴变温快，而上部的微滴变温快。为了保证所有的微滴均匀变温，必须将Ramp rate调到2.5℃/s以下。
• 微滴分析方面
  Q：PCR结束后的微滴可以放置一晚上后再分析，请问最长的放置时间是多久？
  A：经过实验证明探针法的微滴PCR后放置一周，仍能读取无显著差异的结果，最长时间未知。
  Q：影响微滴荧光强度因素有哪些？是否与PCR扩增循环次数相关？一般控制PCR扩增次数为多少？
  A： 阳性微滴的荧光强度与微滴的PCR扩增情况（包括扩增效率、循环数）有关，也跟assay的终浓度、样本的情况（如是否含有大量抑制物）有关。如果循环数没有达到微滴中PCR反应的平台期，则微滴荧光强度会较低，如果微滴内PCR反应已达到平台期则没有影响。但ddPCR的检测原理决定其只要阴阳性微滴可以明显区分即可，所以对循环数并没有强行要求。
  如果阳性微滴和阴性微滴区分不明显，或者“下雨”的现象比较严重，那么优化的步骤可包括增加PCR循环数至45-50循环，或者增加延伸时间，以促进微滴充分扩增至平台期。
  影响微滴荧光信号的因素很多，有些已知，有些未知。已知因素包括探针的浓度，抑制物、退火温度，微滴的大小，PCR扩增效率

4.8 阈值线方面

• Q：如何保证在同一个assay研究同一个指标时，阈值的划线一致？如果划线不一致，如何能让结果更有说服力？
  在样本纯度一致的情况下，同一个assay的阴性微滴本底荧光强度是一致的，只要在一维图中统一划在阴性对照的微滴到以上、或在二维图中按照阳性对照微滴分群进行索套即可。如果因为样本不纯或微滴生成中的意外情况导致本底和扩增效率等发生变化，可以使用索套工具在二维图中先对于内参/野生型阳性微滴群进行判断（如果样本含有核酸且实验成功则内参必为阳性），进而通过四角定位和微滴的聚集性（可参考热度图）确定无模板微滴、目的/突变型微滴、双阳性微滴。
• Q：对于开发一个基于ddPCR平台的IVD临床辅助诊断产品，如何结合ddPCR的背景，制定产品的cutoff？ddPCR的背景一般在什么水平，如何确定？
  这里的背景是否是指假阳性率FPR？假阳性的产生跟很多因素有关，如assay的设计，样本类型和处理过程（如FFEP样本，C>T transition）,靶标序列variation, 生化反应本身的随机性，还有就是最重要的样本交叉污染，气溶胶污染。有些因素的可以竭力控制的，使得FPR尽量的低。尽管如此，通过严格的设计和质控来控制FPR不是不可能的，可使FPR接近零的水平。
  Cutoff值的设定，对于某个assay来说，其实不是纯粹技术上的问题，还涉及到产品类型、策略、市场定位，检测目标等考虑因素。过低的Cutoff，可提高灵敏度，筛出更多“阳性”病人，但是也增加了假阳性的风险，企业承担更大的风险

4.9 biorad ddPCR的分析灵敏度、重复性在什么水平？

理论灵敏度为1个拷贝核酸。实际灵敏度针对您的不同Assay及不同提取手段是需要具体分析的，重复性在不同Assay的不同的浓度范围内也是不同的。您需要参考文献、自身实验、或FDA医疗器械注册时的验证数据。
对于一台PCR仪器一般很少有用分析灵敏度的说法，因为每一种不同的序列都可以判断为不同的分析物，同一种方法针对不同分析物的LLD、BLD、AS、FS都是不同的，需要精确到不同的应用方向和应用试剂。

4.10 Q：每个微滴的体积在Quanta Soft中的算法是多少？

A：Bio-Rad不同的ddPCR supermix产生的微滴体积都有差别，这就是为什么要在setup实验时，要在软件中正确选择对应的supermix种类，软件会自动调用对应试剂的微滴体积进行计算。不同试剂的微滴体积，在研发时已经通过测试获得并应用于quantasoft软件的计算中

4.11 Q：分析软件中的merge功能及在什么情况下使用？

A：1.单孔微滴数量不够，2. 单孔样本上样量不够，3. 需要计算技术重复间的平均值和置信区间。如果实验中有perform技术重复，通常情况下建议merge各技术重复的微滴进行分析，可提高数据的精确度

4.12 Q：分析软件lasso功能在什么情况下使用？

A：双重ddPCR实验中，如果两重反应间互有干扰或竞争（表现形式一般为四团微滴无法处于矩形的线上），则使用索套法划分微滴会更精确。（如有实例，可现场讨论）

4.13 Q： 使用ddPCR开发assay是以拷贝数还是以突变比例作为LOD?

这两个定量结果其实并不矛盾。但对于ddPCR开发的mutation detection assays, 到底该用拷贝数还是用突变率作为LOD仍然有待讨论。对于Liquid biopsy来说，可能两个检测结果同时分析才更有实际指导意义。个人倾向于用拷贝数浓度，而野生型的结果是必不可少的IPC。突变比例的测定可能会受样本制备的影响。

4.13 Q：从伯乐ddPCR资料中有如下校正情况，请问：为什么需要校正？在什么条件下需要校正？

如果加入新的荧光标记或者阴性微滴的本底荧光信号出现负值时，需要校正补偿。