外显子测序分析

2023-04-28 本文已影响0人千容安

一、外显子测序分析可以得到以下结果：

变异位点的检测和注释
基因突变的检测和注释
拼接剪接位点的检测和注释
基因外显子区域的覆盖度分析
基因外显子区域的差异表达分析
基因功能富集分析

二、利用外显子测序数据得到肿瘤特异性靶标的流程一般包括以下几个步骤：

数据预处理：包括测序数据的质量控制、去除低质量序列、比对到基因组参考序列等。
变异检测：利用不同的软件对测序数据进行变异检测，筛选出与肿瘤相关的变异位点。
变异注释：对变异位点进行注释，包括变异的类型、位置、影响等信息。
功能分析：对注释的结果进行功能富集分析，筛选出与肿瘤相关的基因和通路。
靶标筛选：根据功能分析的结果，筛选出与肿瘤相关的靶标，进行进一步的实验验证。

具体流程还需要根据具体的实验设计和数据分析要求进行调整。

外显子测序数据分析中常用的软件和工具：

数据预处理：Trimmomatic、FastQC、BWA、SAMtools等。
变异检测：GATK、VarScan、Mutect2、Strelka等。
变异注释：ANNOVAR、VEP、SNPEff等。
功能分析：DAVID、GOseq、KEGG等。
靶标筛选：Cytoscape、STRING、GeneMANIA等。

需要注意的是，具体软件的选择还要根据实验设计、数据类型和分析需求等因素进行综合考虑。

基础命令：
bwa mem hg38.fa HRR573094_f1.fq.gz HRR573094_r2.fq.gz > mem-pe.3094.sam

可添加的参数：

-t：指定线程数。可以根据计算机配置来设置。比如，有8个CPU核心可用，可以设置为"-t 8"，以加快比对速度。
-M：生成CIGAR字符串中的M标记，表示匹配和误配。这个选项会让BWA生成一个SAM文件，其中包含了所有的比对结果。如果只需要最好的比对结果，可以去掉这个选项。
-R：指定read group信息。这个信息对于后续的数据分析很重要，建议填写。可以参考以下格式：-R "@RG\tID:group1\tSM:sample1\tPL:illumina\tPU:unit1"
-B：指定比对算法。BWA有三种比对算法可以选择，分别是"mem"、"bwasw"和"aln"。其中，默认的是"mem"算法，适用于短读长于70bp的情况。

综上所述，可以使用以下命令进行比对：
bwa mem -t 8 -M -R "@RG\tID:group1\tSM:sample1\tPL:illumina\tPU:unit1" ref.fa read1.fq.gz read2.fq.gz > mem-pe.sam

使用循环语句来批量处理数据。下面是一个示例脚本，可以批量处理一个目录下的所有双端测序数据：

bash
#!/bin/bash
# 批量比对双端测序数据

# 1. 定义变量
REF="hg38.fa"
THREADS=8
DIR="data"  # 存放数据的目录
OUTDIR="output"  # 存放比对结果的目录

# 2. 创建输出目录
mkdir -p $OUTDIR

# 3. 处理每个样本
for file in $DIR/*.fq.gz
do

# 3.1 获取文件名和路径
filename=$(basename "$file")
sample="${filename%.*}"
   
 # 3.2 执行比对命令
bwa mem -t $THREADS -M -R "@RG\tID:$sample\tSM:$sample\tPL:illumina\tPU:unit1" $REF $DIR/${sample}_1.fq.gz $DIR/${sample}_2.fq.gz > $OUTDIR/${sample}.sam

# 3.3 转换为BAM格式并排序
samtools view -b -S $OUTDIR/${sample}.sam | samtools sort -o $OUTDIR/${sample}.bam -

# 3.4 建立索引
samtools index $OUTDIR/${sample}.bam
done

上述脚本中，我们首先定义了参考基因组文件和线程数等变量，然后创建了一个用于存放比对结果的目录。接下来使用for循环遍历指定目录下的所有双端测序数据，依次执行比对命令、转换为BAM格式并排序、建立索引等操作。

可以将上述脚本保存为.sh文件，然后使用终端运行即可。需要安装BWA和SAMtools等软件，并将它们的可执行文件添加到系统环境变量中，才能在终端中直接运行命令。

在Illumina测序中，每个测序文库都有一个唯一的标识符，称为“read group”。这个标识符可以用来区分不同的测序文库，并且可以提供有关测序数据的更多信息，例如测序平台、测序日期、测序文库类型等。在数据分析中，read group信息可以帮助我们更好地理解和解释数据。

下面是一个read group信息的示例：

@RG\tID:group1\tSM:sample1\tPL:illumina\tPU:unit1

其中，\t表示制表符，\n表示换行符。各个字段的含义如下：

ID：测序文库的唯一标识符。
SM：样本名称，即测序文库对应的样本名称。
PL：测序平台，例如Illumina、Ion Torrent等。
PU：测序文库的物理标识符，例如测序文库的barcode或lane信息等。

这个示例中的read group信息表明这个测序文库的唯一标识符是group1，对应的样本名称是sample1，测序平台是Illumina，物理标识符是unit1。

在Cell Ranger中，使用-R参数可以指定read group信息。如果您不确定如何填写read group信息，可以参考Illumina官方文档或者咨询测序服务商。

shell的命令搞不定。。自己写的python脚本挺好用。。

#批量执行bwa
def bwa():
    import os
    for i in range(573200,573230):
        x = "HRR" + str(i)
        cmd_string = "bwa mem -t 8 -M hg38.fa "+x+"_f1.fq.gz "+x+"_r2.fq.gz > /mnt/bwa-0.7.17/output/"+x+".sam"
        print('x：{}'.format(cmd_string))
        print(os.popen(cmd_string).read())
                
bwa()

#批量执行samtools
def samtools():
    import os
    for i in range(573185,573200):
        x = "HRR" + str(i)
        cmd_string = "samtools view -bS /mnt/bwa-0.7.17/output/"+x+".sam > /mnt/bwa-0.7.17/output/"+x+".bam"
        print('x：{}'.format(cmd_string))
        print(os.popen(cmd_string).read())
samtools()

外显子测序分析

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