转录组分析1——原始数据以及过滤

2020-04-30 本文已影响0人猪莎爱学习

Counts值

对给定的基因组参考区域，计算比对上的read数，又称为raw count（RC）。
计数结果的差异的影响因素：落在参考区域上下限的read是否需要被统计，按照什么样的标准进行统计。

RNA-Seq的数据，目前普遍是使用counts数据进行差异分析，但是counts数据进行差异分析就要对counts数据进行标准化。

目前生信公司普遍使用DESeq、DESeq2和edger等R包，以counts数据作为输入进行差异分析，其程序内部会对counts数据进行数据标准化。

短读长与长读长RNA-seq平台

image.png

RNA-Seq主要有三个步骤，分别是第一：建库；第二，测序；第三，数据分析

上游分析的基本流程

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转录组数据分析准备工作

# 创建名为rna的小环境
conda create 
-n rna python=3
# 激活小环境
conda activate rna
# 安装软件
conda install 
-y sra
-tools
# 批量安装
conda install 
-y sra
-tools fastqc hisat2
trim
-galore subread multiqc samtools
salmon
# 退出小环境
conda deactivate

示例数据集：GSE52778

1、先登录界面找到这个数据集所在位置：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov//geo/query/acc.cgi?acc=GSE52778
2、点击SRA Run selector

image.png
3、点击Accession List:会出来一个txt文件，列表和下方表格是一样的

image.png

补充知识点：
Short Read Archive（SRA）(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)是NCBI
提供的数据存储服务，储存海量的公开的高通量测序数据。
• NCBI BioProject：PRJN ****（例如：PRJNA229998）包含单一研

究计划的总体描述；项目通常涉及多个样本和数据集。
• NCBI BioSample：SAMN ****和/或SRS ****（例如：
SAMN02422669）描述生物来源材料；每个物理上独特的标本应注
册为具有一组独特属性的单个BioSample。
• SRA实验：SRX ****是特定样品的独特测序文库（SRX384345）
• SRA Run：SRR ****或ERR ****（例如：SRR1039508）是链接到给
定测序库（实验）的数据文件的清单。
🤭我们需要把SRA文件转换为Fastq文件才能进行后续的分析

SRA

NCBI有专门针对SRA数据的工具包，就是箭头所指的SRA Toolkit，可以下载SRA文件

还有一种下载方式就是从ENA下载：

ENA:https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home

image.png

参考：https://mp.weixin.qq.com/s/G4UQNUNXqOzeLVypOJIf6Q

第3种下载方式：SRA Explorer

网址：https://sra-explorer.info/

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点击SRR1039508之后会自动跳转NCBI SRA的网页

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下载方式不推荐从NCBI的SRA下载，更推荐用ENA或者是SRA Explorer

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上游分析就是从SRA开始，然后用fastq-dump转换成fastq文件，然后对fastq文件进行过滤，去掉低质量的reads，以及接头，然后获得clean reads，然后再把clean reads比对（mapping:比对）回参考基因组，比对完成之后，会得到sam，把sam文件转换成bam文件再对bam文件进行计数，也就是counts，就会得到基因的表达矩阵，然后读入R就可以做下游分析了。

创建工作目录

后面就可以直接用代码进行分析了

小贴士：prefetch命令下载数据是非常慢的，所以推荐用Aspera下载，它的下载速度最高可以达到好几百MB/s，但是因为这个速度非常快，如果用云服务器可能会被官方强制下线。。所以可以用自己的实体服务器来下载
运行命令是：ascp

常用参数
注意

Fastq格式：测序得到的是带有质量值的碱基序列(fastq格式)

有4行

每行的意思

质量评估软件：FastQC软件

FastQC软件可以对fastq格式的原始数据进行质量统计，评估测序结果，为
下一步修剪过滤提供参考。

FastQC主页：http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/

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FastQC实际运行命令

对单个FastQ文件进行质量评估：

image.png
批处理，对所有FastQ文件进行质量评估：

image.png

测序数据的质量评估结果

image.png

使用MultiQC整合FastQC质量评估结果

MultiQC官网：https://multiqc.info/

image.png

MultiQC的主要参数：
--help # 打印MultiQC的帮助信息
-o / --outdir # 指定输出文件夹。

image.png

然后在Xshell中就可以点击xftp下载这两个文件到本地查看

原始数据的修剪/过滤

过滤标准：
• 去除碱基质量值低于20的reads
• 去除N比例高于百分之5的reads
• 去除Index或接头
• 去除一些reads的head或tail
数据过滤的软件：cutadapter，trimmomatic，
trim_galore，fastp
质量控制的重要性：https://www.jianshu.com/p/7a3de6b8e503