原核表达常见问题-蛋白浓缩及后续操作
1.关于蛋白浓缩管（超滤管）的选择，现存市面上生产超滤管的公司有很多家，常用的主要为默克密理博的Amicon离心超滤管，离心超滤管会有一个类似于内管和外管的两个部分，内管中是带有一定分子量的膜，当高速离心时，分子量比它小的就漏到下面的管子(即外管)中了，分子量比它大的就截留在上面(即内管中)，就是超滤的原理。超滤离心管的选择主要看你要截留那部分物质，就选择比最小分子量小的，如果你要截留13KD的，你要的超滤管就要比13KD小。但两者也要有一定的差距，比如，选择20KD之间的就不合适，因为26的也可能会出去(这是由制造工艺决定的)。所以选择10KD以下的超滤管比较合适。
以下是参考说明书给大家总结的使用方法和注意事项。
1、选择合适的超滤管，主要参考MWCO和浓缩体积，最常见的是10kD。到底选择多大截留分子量比较合适呢?10kDa、 5kDa、还是30kDa?通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为35kDa，就可以选择10kDa截留分子量的超滤 管。若目的蛋白分子量为10kD左右，则可以用截留分子量3kD的超滤管。使用时请认真阅读使用说明书。
离心管，过滤器，盖子
2、新买来的超滤是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全过膜，冰浴或冰箱里预冷5-10分钟。然后将水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超过管顶的白线为准。操作要轻，加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。
3、平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快，否则直接损坏超滤膜。开始离心超滤(离心机预冷至4度)。不同离心机的转速 rpm换算成g之后，有所不同。具体可参阅附件里的说明书。离心机的加速度调至最低档，减小对膜的压力。注意，一定要等离心机达到目的转速之后，方可离开离心机，否则离心机出问题时，无法第一时间处理，后果不可预测!膜与转轴的方向根据说明书调整(角转离心机的情况是膜与轴垂直)。在实际使用中，一般转速开的比说明书里的要低，这样可以延长离心管的使用寿命，一般选择3000-4000rpm，30min。
4、当浓缩到剩下1-1.5ml时，继续加入剩下的蛋白液浓缩(在冰上操作，防止蛋白受热)，直到所有浓缩液都加完为止。离心过程中注意是否发生蛋白沉淀，导致堵管。若发生沉淀，要确定沉淀的具体原因，是蛋白浓度过高还是Buffer不合适;前者可用多根超滤管同时超滤，降低浓度的办法解决，后者的方法是换不同的Buffer，直到蛋白不发生沉淀为 止。
5、前面几步用以浓缩蛋白，如果要换Buffer，在总蛋白液浓缩至1ml左右的时候，轻轻加入新的Buffer(经0.22um超滤膜超滤)，再 浓缩至1ml左右，连续三次，最后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定，一般不多于500ul，也有浓缩至200ul以内的情况。按照每次至少10倍 左右的体积浓缩算，三次达到1000倍以上，基本上可以达到换buffer的目的。
6、取出最终蛋白浓缩液的操作在冰上操作，用黄枪头(200ul)取，轻轻顺着边缘插入枪头，轻轻吹打、混匀蛋白液，注意不要碰到超滤膜，然后吸取浓缩液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最后一点浓缩液不必吸取，否则难度太大，有可能损坏超滤膜。最后加入MilliQ水到超滤管中，没过 超滤膜，防止膜失水变干。
以下是处理超滤管，重复利用超滤管的步骤。
7、倒出超滤管里的水，用milliQ水轻轻润洗几次，【若管底有可见的蛋白沉淀，可以先加入水，然后用枪头吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉淀悬起，然后倒掉，不可用自来水猛冲】然后加入0.2M的NaOH溶液，室温放置20min，期间平衡超滤管。再离心10min。倒出残留的NaOH溶液，将 管芯浸入MilliQ水的烧杯(1或2L)中,放置几个小时,再换新的水,放置几个小时，不断稀释NaOH浓度。50ml管和盖子用自来水洗，内壁再用 MilliQ水洗干净。
8、取出浸没的管芯，加至接近满的MilliQ水，50ml管也加满MilliQ水，将管芯慢慢放入50ml离心管，排出部分水，然后盖上盖子，放4度保存，直到下次使用。一般来说，按照上述步骤和注意事项，每根管用三四年不会坏。
关于超滤管的常见问题与解答
Q:超滤管的膜材质是什么?
A:超滤管的膜材质为默克密理博特有的Ultracel再生纤维素膜，生产工艺严格,截留分子量明确而准， 蛋白吸附损失小。
Q:如果要用超滤的方法分离两种蛋白，那么这两个蛋白的大小需要相差多少?
A:按照经验,建议两个蛋白的分子量要相差 一个数量级(10倍)。
Q:超滤管可以用酒精消毒灭菌么?
A: 超滤管与70%乙醇是兼容的，但是对灭菌处理的具体方法没有做相关的测试，所以无法提供更进一步的参考信息。
Q:超滤装置是否可以用于高压灭菌?
A: 超滤管都是采用热封设计,不可以用高压高温灭菌。
Q:蛋白在浓缩时出现了沉淀,如何改进?
A:蛋白如果浓缩过快或者过度浓缩都有可能引起蛋白沉淀。建议蛋白浓缩后的 浓度不超过20mg/ml.对于对浓缩速度敏感而容易沉淀的蛋白，建议的改进方法是:
1)离心力降为推荐离心力的30%-50%
2)改用截留分子量大的超滤管(如原本选用10k,此时可以选择30k)
3)在浓缩过程中取出超滤管, 用吸头反复吹吸几次后再继续浓缩
Q:浓缩后发现浓缩液中没有目的蛋白,可能的原因有哪些?
A:首先,超滤管的蛋白起始浓度为25ug/ml.请确保样本的起始浓度大于这个浓度。其次,如果问题仍然出现，请不要丢弃样本滤过液以便用于分析可能的原因:
1)如果目的样本在滤过液中，那么请排查: .
a)是否选择了合适截留分子量的超滤管(目的蛋白分子量的1/2或者1/3)?
b)使用的离心力是否是在限定范围内?如果使用的是rpm,请换算成相应的g离心力,
Q:有时候用超滤离心管连水都离不下来,可能是什么原因?
A:超滤膜中含有微量甘油。如果出现这种情况,请先用0.1 M NaOH清洗再离心。最后用缓冲液或Milli-Q水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用，如暂时不用,请保持润湿状态,避免重新干燥。
常见载体（二）
别名:pGEX-4T-1, pGEX4T1, pGEX 4T 1
载体类型：大肠杆菌蛋白表达载体
载体抗性：Ampicillin 氨苄
载体标签：N-GST
表达水平:高拷贝
载体大小:4969 bp
启动子：Tac
克隆方法:多克隆位点，限制性内切酶
5' 测序引物:pGEX5': 5’-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3’
3' 测序引物：pGEX3': 5’-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3’
稳定性:瞬时表达 Transient
组成型/诱导型:诱导表达
病毒/非病毒非病毒
备注复制子是pMB1。
载体图谱：
载体描述
pGEX-4T-1载体是一种常用的原核表达载体，具有Amp抗性，质粒大小为4.9 kb。该载体多克隆位点区域含有多个常用的内切酶位点序列，便于不同基因的克隆；且全序列中含有tac启动子、GST标签序列，是一种高效的蛋白表达载体。Tac启动子在没有诱导物存在的情况下，质粒上携带的lacIq基因产物可以有效抑制tac启动子的转录。可在BL21、Rosstea等表达菌株中高表达融合有GST标签的蛋白，且用凝血酶可将目的蛋白的GST标签切掉，便于下游蛋白纯化。
载体序列
LOCUS Exported 4969 bp ds-DNA circular SYN 14-MAR-2019
DEFINITION synthetic circular DNA
ACCESSION .
VERSION .
KEYWORDS .
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 4969)
AUTHORS .
TITLE Direct Submission
JOURNAL Exported Thursday, Mar 14, 2019 from SnapGene Viewer 4.3.4
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..4969
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
promoter 183..211
/label=tac promoter
/note="strong E. coli promoter; hybrid between the trp and
lac UV5 promoters"
protein_bind 219..235
/label=lac operator
/bound_moiety="lac repressor encoded by lacI"
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
CDS 258..911
/codon_start=1
/product="glutathione S-transferase from Schistosoma
japonicum"
/label=GST
/translation="MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKK
FELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRY
GVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVL
YMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPK"
primer_bind 869..891
/label=pGEX5'
CDS 918..935
/codon_start=1
/product="thrombin recognition and cleavage site"
/label=thrombin site
/translation="LVPRGS"
misc_feature 936..966
/label=MCS
primer_bind complement(1019..1041)
/label=pGEX3'
promoter 1272..1376
/gene="bla"
/label=AmpR promoter
CDS 1377..2237
/codon_start=1
/gene="bla"
/product="beta-lactamase"
/label=AmpR
/note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
related antibiotics"
/translation="MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYI
ELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYS
PVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRW
EPELNEAIPNDERDTTMPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSA
LPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGAS
LIKHW"
rep_origin 2408..2996
/direction=RIGHT
/label=ori
/note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
promoter 3240..3317
/gene="lacI (mutant)"
/label=lacIq promoter
/note="In the lacIq allele, a single base change in the
promoter boosts expression of the lacI gene about 10-fold."
CDS 3318..4400
/codon_start=1
/gene="lacI"
/product="lac repressor"
/label=lacI
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
/translation="MKPVTLYDVAEYAGVSYQTVSRVVNQASHVSAKTREKVEAAMAEL
NYIPNRVAQQLAGKQSLLIGVATSSLALHAPSQIVAAIKSRADQLGASVVVSMVERSGV
EACKAAVHNLLAQRVSGLIINYPLDDQDAIAVEAACTNVPALFLDVSDQTPINSIIFSH
EDGTRLGVEHLVALGHQQIALLAGPLSSVSARLRLAGWHKYLTRNQIQPIAEREGDWSA
MSGFQQTMQMLNEGIVPTAMLVANDQMALGAMRAITESGLRVGADISVVGYDDTEDSSC
YIPPLTTIKQDFRLLGQTSVDRLLQLSQGQAVKGNQLLPVSLVKRKTTLAPNTQTASPR
ALADSLMQLARQVSRLESGQ"
protein_bind 4413..4434
/label=CAP binding site
/bound_moiety="E. coli catabolite activator protein"
/note="CAP binding activates transcription in the presence
of cAMP."
promoter 4449..4479
/label=lac promoter
/note="promoter for the E. coli lac operon"
protein_bind 4487..4503
/label=lac operator
/bound_moiety="lac repressor encoded by lacI"
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
primer_bind 4511..4527
/label=M13 rev
/note="common sequencing primer, one of multiple similar
variants"
CDS 4523..4969
/codon_start=1
/gene="lacZ fragment"
/product="LacZ-alpha fragment of beta-galactosidase"
/label=lacZ-alpha
/translation="MTMITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEART
DRPSQQLRSLNGEWRFAWFPAPEAVPESWLECDLPEADTVVVPSNWQMHGYDAPIYTNV
TYPITVNPPFVPTENPTGCYSLTFNVDESWLQEGQTRIIFDGVGI"
primer_bind complement(4543..4559)
/label=M13 fwd
/note="common sequencing primer, one of multiple similar
variants"
ORIGIN
1 acgttatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc ggaagctgtg
61 gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt
121 tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc
181 tgttgacaat taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca
241 cacaggaaac agtattcatg tcccctatac taggttattg gaaaattaag ggccttgtgc
301 aacccactcg acttcttttg gaatatcttg aagaaaaata tgaagagcat ttgtatgagc
361 gcgatgaagg tgataaatgg cgaaacaaaa agtttgaatt gggtttggag tttcccaatc
421 ttccttatta tattgatggt gatgttaaat taacacagtc tatggccatc atacgttata
481 tagctgacaa gcacaacatg ttgggtggtt gtccaaaaga gcgtgcagag atttcaatgc
541 ttgaaggagc ggttttggat attagatacg gtgtttcgag aattgcatat agtaaagact
601 ttgaaactct caaagttgat tttcttagca agctacctga aatgctgaaa atgttcgaag
661 atcgtttatg tcataaaaca tatttaaatg gtgatcatgt aacccatcct gacttcatgt
721 tgtatgacgc tcttgatgtt gttttataca tggacccaat gtgcctggat gcgttcccaa
781 aattagtttg ttttaaaaaa cgtattgaag ctatcccaca aattgataag tacttgaaat
841 ccagcaagta tatagcatgg cctttgcagg gctggcaagc cacgtttggt ggtggcgacc
901 atcctccaaa atcggatctg gttccgcgtg gatccccgga attcccgggt cgactcgagc
961 ggccgcatcg tgactgactg acgatctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc
1021 tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca
1081 gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc
1141 agtcacgtag cgatagcgga gtgtataatt cttgaagacg aaagggcctc gtgatacgcc
1201 tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc
1261 ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc
1321 cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga
1381 gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt
1441 ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag
1501 tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag
1561 aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgtg
1621 ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg
1681 agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca
1741 gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag
1801 gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc
1861 gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg
1921 cagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc
1981 ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg
2041 cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg
2101 gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga
2161 cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac
2221 tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa
2281 aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca
2341 aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag
2401 gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac
2461 cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa
2521 ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc
2581 accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag
2641 tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac
2701 cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc
2761 gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc
2821 ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca
2881 cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc
2941 tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg
3001 ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct
3061 ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata
3121 ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc
3181 gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc ataaattccg
3241 acaccatcga atggtgcaaa acctttcgcg gtatggcatg atagcgcccg gaagagagtc
3301 aattcagggt ggtgaatgtg aaaccagtaa cgttatacga tgtcgcagag tatgccggtg
3361 tctcttatca gaccgtttcc cgcgtggtga accaggccag ccacgtttct gcgaaaacgc
3421 gggaaaaagt ggaagcggcg atggcggagc tgaattacat tcccaaccgc gtggcacaac
3481 aactggcggg caaacagtcg ttgctgattg gcgttgccac ctccagtctg gccctgcacg
3541 cgccgtcgca aattgtcgcg gcgattaaat ctcgcgccga tcaactgggt gccagcgtgg
3601 tggtgtcgat ggtagaacga agcggcgtcg aagcctgtaa agcggcggtg cacaatcttc
3661 tcgcgcaacg cgtcagtggg ctgatcatta actatccgct ggatgaccag gatgccattg
3721 ctgtggaagc tgcctgcact aatgttccgg cgttatttct tgatgtctct gaccagacac
3781 ccatcaacag tattattttc tcccatgaag acggtacgcg actgggcgtg gagcatctgg
3841 tcgcattggg tcaccagcaa atcgcgctgt tagcgggccc attaagttct gtctcggcgc
3901 gtctgcgtct ggctggctgg cataaatatc tcactcgcaa tcaaattcag ccgatagcgg
3961 aacgggaagg cgactggagt gccatgtccg gttttcaaca aaccatgcaa atgctgaatg
4021 agggcatcgt tcccactgcg atgctggttg ccaacgatca gatggcgctg ggcgcaatgc
4081 gcgccattac cgagtccggg ctgcgcgttg gtgcggatat ctcggtagtg ggatacgacg
4141 ataccgaaga cagctcatgt tatatcccgc cgttaaccac catcaaacag gattttcgcc
4201 tgctggggca aaccagcgtg gaccgcttgc tgcaactctc tcagggccag gcggtgaagg
4261 gcaatcagct gttgcccgtc tcactggtga aaagaaaaac caccctggcg cccaatacgc
4321 aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc
4381 gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca
4441 ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa
4501 caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacggat tcactggccg tcgttttaca
4561 acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc
4621 tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg
4681 cagcctgaat ggcgaatggc gctttgcctg gtttccggca ccagaagcgg tgccggaaag
4741 ctggctggag tgcgatcttc ctgaggccga tactgtcgtc gtcccctcaa actggcagat
4801 gcacggttac gatgcgccca tctacaccaa cgtaacctat cccattacgg tcaatccgcc
4861 gtttgttccc acggagaatc cgacgggttg ttactcgctc acatttaatg ttgatgaaag
4921 ctggctacag gaaggccaga cgcgaattat ttttgatggc gttggaatt
//
