基因检测头脑风暴

. 实质

找出和正常人不同的基因，再评估这些基因变异产生的影响，并定位到与表型有关的基因变异信息

. 应用领域

• 产前筛查：孕妇外周血液-》胎儿染色体类疾病（21三体、18三体综合征）
• 肿瘤患者：致病突变-》靶向治疗药物、化疗药物
• 遗传病：单基因遗传病（目前大于4000种有明确致病基因）-》辅助诊断、评估预后
• 个人健康检测：预测未来患病风险-》提前预防

. 表型

• 每个人表现的特征，如肤色、智力、身高等
• 几乎都和遗传相关
• 疾病也是表型，如运动障碍、智力障碍
  除了遗传因素（染色体异常、单基因缺陷等），还有环境因素（营养、理化因素、外伤感染等）且影响大小不一

. 遗传因素

• 细胞--生命基本单位
  • 人体有40万亿-60万亿细胞，平均直径10-20微米；
  • 细胞核--含有遗传物质​
  • 细胞器：多个部分行使不同功能（线粒体、内质网、溶酶体、高尔基体等）​​
• 遗传物质：
  • 绝大多数在细胞核（除了成熟红细胞和血小板没有细胞核）
  • 小部分在线粒体​​
• 细胞核--染色体
  • 23对（常1-22 + 性），46条；23条来自母亲，23条来自父亲
• DNA
  • 与组蛋白合成染色体；
  • 平面结构双链，立体结构超螺旋​
  • 计量单位bp​
• 基因
  • 一段具有遗传效应的DNA片段，排布在双链上，ATCG排列组合得到
• 基因组
  • 细胞核中编码蛋白基因22000+个
  • ​​基因在染色体分布不均，1号染色体基因数目最多（基因组大小248.96Mb，编码的蛋白质11046种）；
  • 线粒体基因组​有37个基因，2个编码rRNA，22个编码tRNA，13个编码多肽
• 基因组计划
  • “Human Genome Project”--“生命科学登月计划”--美英法德日中
  • 1953年DNA双螺旋结构-》1990HGP启动-》1999中国加入-》2000草图完成-》2003提前两年完成​（搞清楚了许多基因位置、结构和组成）​

. 基因变异

• 基因功能
  • 指导蛋白质合成--基因表达：DNA序列的遗传信息-》转录、翻译-》生物活性蛋白分子（作为除水以外的最主要组成）
• 基因与蛋白
  • 密码子（每3个相连核苷酸）-》编码一个氨基酸aa（如：AGA编码精氨酸，GCA丙氨酸）-》aa组成蛋白质
• 基因突变
  • 定义：组成基因的DNA序列永久性改变
  • 过程：碱基改变-》密码子改变-》氨基酸可能改变（考虑简并性）​-》蛋白结构改变-》结构决定功能，功能改变-》遗传病或肿瘤​
• 突变来源
  • 来源一： 胚系（生殖细胞）突变​【遗传病】
    遗传病基因检测常见​​
    ​突变来自父母卵子或精子，几乎存在每个细胞
    精卵结合-》DNA结合-》如果DNA有一个突变，受精卵发育会一直携带
  • 来源二：获得性（体细胞）突变【肿瘤】
  • 发生在某一生命时间并仅存在与某些细胞，并非整体
  • 可能由于环境（如辐射），​或者细胞分离时DNA复制错误 ，不能遗传​
  • 肿瘤患者基因检测，样本必须是肿瘤组织（因基因信息与其他组织不同）
  • 肿瘤组织要求：​新鲜手术组织、穿刺样本【前两个液氮冷冻，干冰运输】或FFPE（石蜡切片）样本【常温保存运输】
  • 液体活检：【患者没有手术或样本不易获取】取样外周血（带有肿瘤基因组DNA片段-- 循环肿瘤DNA即ctDNA）​，包含肿瘤组织全部基因信息
  • 来源三：新发突变
  • 可来自父母精细胞或卵细胞中突变【父母其他细胞中没有】；
  • 也可在受精卵形成后突变【父母全部细胞正常，子代每个生长的细胞都突变】​
  • 一般不可知发生时间​如：父母没有突变，没有家族史，孩子身体每个细胞都有突变​
• 突变类型- **碱基水平 ** 全外显子检测基因变异数目5w左右，但仅有少部分变异导致遗传病，大多对健康无害【序列改变但最终蛋白的功能不变】 变异是否有害，取决于基因变异是否影响编码蛋白​​
  • 单核苷酸变异(Single nucleotide variation) SNV
  • 基因组某个位置的单个碱基变异
  • 第一种：错义突变
    • 密码子受碱基突变影响发生改变-》多肽链的aa种类和序列改变-》丧失原有功能
  • 第二种：同义突变
    • 碱基突变，新密码子产生-》密码子简并性-》aa种类不变
    • 简并密码子：一个aa由一个以上三联体密码编码【如：精氨酸6种密码子CGU; CGC; CGA; CGG; AGA; AGG】​​
  • 第三种：无义突变
    • 碱基突变使密码子变成终止密码子-》肽链合成提前终止-》蛋白质结构缩短-》可影响甚至完全破坏功能
    • 终止密码子：TAG、TAA、TGA​
  • 插入缺失(Insertion deletion) InDel
  • 插入：插入的DNA序列，可能使产生的蛋白质不能正常运行 有时插入一个碱基，后面编码的aa全部改变​
  • 缺失：缺失范围：一或几个碱基对，甚至整个基因或几个相邻基因 与插入一样，可能导致“蝴蝶效应”​
  • 动态突变
    • DNA分子中某些短串联重复序列重复扩增-》世代交替传递，逐代递增-》累加突变效应
    • 【短串联重复序列：基因编码序列或侧翼序列的三核苷酸​】 【如：脊髓小脑性共济失调(SCA)，正常情况下​ATXN1基因外显子内部的CAG三核苷酸重复使6-39次，而患者为41-81次（SCA 1型）；更严重的SCA 7型，普通人是7-35次，而部分患者高达200次】
    • 重复次数与疾病外显率有关
    • 外显率：群体中某一基因型（通常杂合）表现相应表型的百分率。等于100%成为完全外显​​
  • 移码突变：碱基缺失或增加非3的倍数-》改变基因阅读框-》该位置后一系列编码发生移位错误 得到蛋白质通常无功能​
• 突变类型-染色体水平
  • 染色体数目异常：可能导致身体生长、发育存在问题 细胞分裂过程染色体分离障碍​​
  • 按染色体分类
    • 常染色体数目异常
    • 唐氏综合征，三条21号染色体，每个细胞共有47条
    • 常见三体综合征还有18三体综合征、13三体综合征等
    • 性染色体数目异常
    • Turner综合征[女性先天性性腺发育不良或先天性卵巢发育不良综合征]
      女性患者其中的一条X染色体缺失，每个细胞总共45条染色体
    • Klinefelter综合征（XXY综合征）：先天性睾丸发育不全，核型为47，XXY
  • 按数量分类
    • 整倍性改变
    • 染色体变化数目是单倍体23的整倍数
    • 例如三倍体：223+123=69条染色体​
    • 非整倍性改变
  • 染色体结构异常
  • 插入：一条染色体片段插入另一条染色体
  • 缺失：如：猫叫综合征就是5好染色体部分缺失
  • 重复：增加某一段
  • 倒位：颠倒180度，染色体内重新排列，如女性习惯性流产《- 9号长臂倒置​
  • 易位：染色体某一片段接到同一条不同区域或另一条非同源染色体，如：惯性粒白血病（14号与22号易位）
  • 环状染色体：染色体长短臂同时断裂，带有着丝粒的两端重接
  • 等臂染色体：​染色体两臂的基因种类、数量、排列对称相同

. 遗传病检测

• OMIM数据库

  • 《人类孟德尔遗传》（Mendelian Inheritance in Man，MIM）--“医学遗传界圣经”

  • 包括所有已知的遗传病、遗传决定的性状及基因

  • 对各种疾病的临床特征、诊断、治疗预防的描述

  • 研究了已知有关致病基因的连锁关系、染色体定位、组成结构与功能、动物模型

  • 制定各种遗传病、性状、基因的编号--MIM号【报道疾病必须加MIM号】

  • 1987年在线版OMIM-》关于人类基因与遗传紊乱

  • 针对可遗传基因疾病，包括文本信息、相关参考信息、序列记录、图谱等

  • 截至2018.7.26，其中已明确致病基因的单基因疾病有5182种，已知基因3554个。

OMIM1 OMIM2

• 遗传病分类：三大类

  • 染色体病：染色体数目异常（18三体综合征、Turner综合征等）和染色体结构异常（猫叫综合症）
  • 多基因病：家族聚集，但系谱分析不符合一般的常染色体显、隐性或性连锁【同胞中患病率远低于1/2或1/4】；受环境影响
    -单基因病

• 单基因遗传病

  • 特点：单个发病率低，但种类极多 -》总体发病率高，先天性、致死致残
  • 分类：
  • 【符合孟德尔遗传】常染色体显性/隐性遗传、X连锁显性、X连锁隐性、Y连锁
  • 【不符合孟德尔】线粒体病
  • 常染色体遗传病：致病基因位于第1-22号常染色体上，患病与性别无关
    • 常染色体显性遗传病（Autosomal dominant, AD）：例如致病基因是A，正常为aa：两个等位基因aa其中之一突变，变成A即可发病
      等位基因：同源染色体，相同位置，控制某性状不同形式基因
    • 双亲一个是患者，子代有1/2概率患病；双亲都是患者，至少3/4概率患病，有一个为纯合AA，子代全部患病
    • 一旦患病，容易连续传递
    • 无病子女和正常人结婚，后代一般不再患病
    • 常见病症：家族性高脂蛋白血症、马尔芬氏综合征、威尔逊氏综合征、亨丁顿氏舞蹈病、结肠息肉、阵发性心动过速、体质性低血压、椭圆形红细胞增多症、肌强直性营养不良、先天性肌强直、周期性麻痹、胱氨酸尿症、遗传性球形细胞增多症、颞叶癫痫
    • 常染色体隐性遗传病（Autosomal recessive, AR）：例如致病基因是a，正常为A*，只有aa时才发病
    • 双亲无病但携带致病基因Aa，子代1/4发病
    • 多为隔代遗传
  • X连锁显性（X-linked dominant, XD）:类似AD，只是致病基因在X染色体
    • 男性患者的女儿总是患者，儿子正常
    • 女性患者将疾病传递给男女后代的机会都是1/2
    • 患者的生育率正常前提下，家系中女性患者的数目要比男性患者多约一倍
  • X连锁隐性
    • 男性患者多于女性，因为男性只要有一个a就患病；女性需要两个a
    • 男性的X连锁基因只能从母亲处传来，将来只能传给女儿
    • 如血友病、进行性肌营养不良假性肥大型
  • Y连锁：父子遗传
  • 线粒体病【详见下方】

• 变异种类

  • 单核苷酸突变SNV
  • 插入缺失InDel
  • 前两种突变检测使用全外显子组测序和目标区域捕获测序（基因panel）
  • 线粒体基因突变
    • 线粒体代谢酶缺陷-》ATP合成障碍、能量来源不足
    • 分为：
    • 线粒体DNA突变导致（母系遗传，对线粒体基因组进行基因组测序或位点测序）
    • 核基因突变导致（WES可检出）
  • 拷贝数变异CNV
    • 常见症状：畸形、精神迟滞、多系统疾病
    • 检测技术：
    • 染色体基因芯片分析（Chromosomal Microarray Analysis, CMA），包括比较基因组杂交技术（aCGH）和SNParray 《--不明确怀疑的基因
    • 多重连接探针扩增技术（MLPA）《--患者疾病有明确怀疑致病基因
    • 低倍基因组测序
    • SNP-array
    • 提高检测阳性率，可以结合CNV+WES
  • 动态突变

. 测序技术

• 一代测序：“黄金标准”，来验证二代测序中检测的阳性致病位点
• 全基因组测序（WGS）
  • 测通整个基因组，深度一般30X【深度也就是平均每个位点测的次数=总碱基数/基因组大小】，人类基因子约为30亿碱基（3Gbase），也就是结果为900亿个碱基。另外拿到的fq文件中一个碱基对应一个质量值，二者都以字母表示，也就是得到1800亿字符。目前测序策略一般是PE150，也就是900亿碱基/150bp=6亿条reads，fq文件中每条reads第一行是测序信息，一般是45个字母，总的首行信息有456亿=270亿字符。不算第三行的+号，加起来总共2070亿字符*。一个字符用一个ASCII码来表示，占8个二进制位(bit)，也就是一个字节(Byte)，存储的GB意思是1024的三次方字节。换算一下，90G测序结果=192.78GB存储空间。接下来用gzip压缩，能达到2.7倍压缩率，大概最后能有71GB存储。然后fq.gz再压缩成sra格式，占用空间会更小
  • 涵盖信息全，数据量大，适合各种变异类型检测，但成本高
• 全外显子组测序：利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序
  • 对体内所有蛋白质编码区测序，约占全集因组1-2%
  • 人类外显子组包含22,000多个基因的180,000多个外显子
  • 约85%单基因遗传病的致病突变都发生在基因的外显子区
  • 特点：1. 测序范围广，筛查全面，准确率高，阳性致病基因检出率高，并且早期发病的患者中诊断率较高；2. 测序样本足够大时，可以发现新致病基因； 3. 现在结果为阴性的WES数据，可以日后再遇不断更新的数据库比对，可以说一次测序，永久有用；4.不能覆盖线粒体
  • 基本流程：
  • 采集血液样本，序列捕获（如：安捷伦V6平台），测序（如：HiseqX ten PE150），Q30要大于30%
  • Rawdata QC 数据质控：FastQC / Trimmomatic -》 clean fq
  • Mapping 比对：BWA/samtools/Picard -》 bam
  • Variant Calling 变异输出：GATK+Picard -》VCF（raw variants）
  • Annotation & Filtering 变异过滤和注释: Bedtools、Annovar -》CSV（Annotated variants）
  • 与ExAC、1000G、ClinVar、HGMD、OMIM等数据库对突变进行比对
  • 参考多个不同算法的软件SIFT、PolyPhen2、LRT、MutationTaster、MutationAssessor、FATHMM、REVEL、MCAP进行突变位点功能预测
  • 二代测序确定阳性致病基因位点后，对先证者trio（家系中第一个被确诊的人）和父母样本进行一代测序，验证阳性结果
• 基因panel：
  • 对某个或某些遗传病相关的致病区域进行捕获并测序
    比如，就像研究gene2的3、4号外显子，就只需要在这两个区域进行捕获富集测序
  • 设计的基因有一定的覆盖区域，不局限于位点；设计上会偏重Hospot，即使发现突变位点，也要具体分析突变性质来看是否致病
  • 特点：成本低，但阳性检出率也低；数据有时效性，也就是检出结果为隐性，想要再次验证，需要再次测序

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推荐阅读原文～https://mubu.com/doc/9KgRwR72T0
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