癌症基因组重测序分析五
——体细胞拷贝数变异（CNV）与基因组结构变异（SV）鉴定
1. 什么是CNV？
Deletions and duplications of chromosomal segments are a major source of variation between individual humans and are an underlying factor in human evolution and in many diseases, including mental illness, developmental disorders and cancer. _from P. J. Hastings et al. Nature Reviews Genetics. 2009
在某一条染色体内部或整条染色体的某一区段发生了缺失或增添，导致染色体的某一区域或这条染色体发生了数目上的变化。一般正常二倍体生物细胞内，每种染色体都有两条，一条来自父亲，另一条来自母亲，发生CNV的变异可能导致染色一的区域或整条染色体的数目变为1条（缺失）或3条（增添）等。
2. 研究CNV的方法——芯片(array CGH) or NGS
arrayCGH和NGS研究CNV拷贝数变异
(1) arrayCGH: 大致步骤为首先提取待测样本DNA，进行片段化，然后对不同样本带上各自的荧光标记（如上图所示，待测样本加上红色荧光，参考样本带上绿色荧光），与能结合全基因组任何区域的芯片杂交，如果某段染色体区域发生了拷贝数变异，则其对应位置的探针的荧光变化也会形成相应的变化，通过与参考基因组荧光强弱进行比较来确定是发生了duplication还是deletion。缺点是分辨率不够，只能对几K或几十K的变化进行研究，不能进行几百bp的CNV进行识别。
(2) NGS：步骤大致为样本的片段化，然后进行基因组比对分析，对来自待测样本和参考样本的不同区域测序reads数目进行比较可以知道待测样本不同区域的拷贝数的情况。
3. 鉴定CNV方法举例
CNV-seq, a new method to detect copy number variation usiong high-throughput sequencing （软件地址：http://tiger.dbs.nus.edu.sg/CNV-seq/）
CNV-seq鉴定全基因组拷贝数变异代码参考
NormalBam.hit: 包含了基因组上每个位点的coverage
CNV图示化展示
CNV鉴定结果R语言图示化举例
$ R
# in R command prompt
＞library(cnv)
＞ data ＜-read.delim("somatic.cnv")
＞cnv.print(data)
# output ...
＞cnv.summary(data)
#output ...
＞plot.cnv(data, CNV=4, upstream=4e+6, downstream=4e+6)
＞ggsave("sample.pdf")
4. 其他CNV鉴定方法
(1) ExomeCNV ExomeCNV
(2) Seqseg
(3) CNVnator CNVnator下载
(4)CNVer
5. 基因组结构变异的几种主要方式
(1) Inter-chromosomal translocation (CTX)
Inter-chromosomal translocation
unbalanced:另一条同源重组产物被降解等原因从而引起拷贝数变异；balanced:不引起CNV。
(2) Inversion (INV)
(3) Inter-chromosomal translocation (ITX)
(4) Deletion (DEL)
(5) Insertion (INS)
6. 如何鉴定SV
(1) Soft-clipped reads
soft-clipped reads
soft-clipped reads (https://www.researchgate.net/figure/Soft-clipped-reads-vs-improperly-aligned-reads-at-a-structural-variant-breakpoint-The_fig3_259984275)
(2) CREST鉴定SV原理及步骤
优点：检测的准确性高；缺点：检测的灵敏度不够。因此如果想检测出尽可能多的SV时此款软件不适用。
原理：根据BAN文件第六列CIGAR提取标识为soft-clipped reads的reads，将覆盖某一位点的所有soft-clipped reads的两端各拼接成一条最长的序列，再将得到的这两条序列比对到参考基因组上，然后确定发生SV的是哪两条染色体。
步骤：
A. Get soft-clipped position
Perl extractSClip.pl -i tumor.bam -ref_genome hg19_genome.fa
Perl extractSClip.pl -i normal.bam -ref_genome hg19_genome.fa
B. Remove germline events
Perl countDiff.pl -d tumor.bam.cover -g germline.bam.cover
C. Running the SV detection script
Perl CREST.pl -f somatic.cover -d tumor.bam -g germline.bam -ref hg19_genome -t hg19_genome.2bit
(3) 其他基因组结构变异鉴定方法
A. Breakdancer (Breakdancer)：敏感性高，分辨率不高，利用双端测序
B. Pindel (Pindel)
