TMB预后还可以这么做

今天跟大家分享的是发表在Annals of Translational Medicine (IF: 3.689)杂志的一篇文章，这是一篇关于透明细胞肾细胞癌的突变负荷与免疫浸润的研究。虽然说TMB与肿瘤的话题已经老生常谈了。但是结合肿瘤免疫浸润以及其他热点的新发表文章还是经常能看见。往期也推送过相关文章哦！

TMB分组预后基础版：https://mp.weixin.qq.com/s/LBKWLKqFi7VqNrB3TTelVQ  

Exploration of the relationships between tumor mutation burden with immune infiltrates in clear cell renal cell carcinoma

透明细胞肾细胞癌中肿瘤突变负荷与免疫浸润的关系的探索

该工作主要研究透明细胞肾细胞癌（ccRCC）中肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）与预后以及与免疫浸润的潜在关联。作者从TCGA数据库下载了336例ccRCC患者的体细胞突变数据，并使用“maftools”软件包分析了突变谱。进一步将样本分为高TMB组和低TMB组。对两组样本进行差异表达分析，鉴定了9个与TMB相关的生物标志物。发现单核苷酸多态性（SNP）的发生率高于插入或缺失，且C>T的突变是ccRCC中单核苷酸变异中最常见的。且发现较高的TMB水平会导致较差的生存结果。此外，发现9个与生存相关的基因。高TMB组的CD8 + T细胞，CD4 +记忆静止T细胞，M1和M2巨噬细胞以及树突状静止细胞的浸润水平低于低TMB组，尤其是CD8 + T细胞和巨噬细胞与ccRCC的预后呈负相关。最后，作者利用多因素cox回归计算肿瘤突变负荷预后指数（Tumor Mutation Burden Prognostic Index，TMBPI），ROC曲线的AUC为0.666。总而言之，较高的TMB与不良的预后是相关的，并可能抑制ccRCC的免疫浸润水平。

材料方法

首先从GDC下载ccRCC病人的突变数据，利用R语言maftools进行突变数据分析。并下载了病人的临床信息。接着计算了每个病人的突变负荷，并将病人分为高突变负荷和低突变负荷组，并对不同组绘制KM曲线，进一步利用wilcoxon秩和检验计算两组之间突变负荷的差异性。

接着，计算了两组之间的差异表达基因，筛选log2|FC|>2，fdr<0.05认为是差异表达基因。并对差异基因利用clusterProfiler工具进行功能富集分析。然后挑选差异表达基因中19个免疫基因进行生存分析，挖掘预后相关基因。基于TIMER数据库的“SCNA”模块评估了ccRCC中不同突变水平的病人的免疫浸润水平的差异性。利用CIBERSORT对样本进行免疫浸润评估，并利用wilcoxon秩和检验计算高低突变负荷组的免疫浸润水平。进一步进行预后分析采用的是survival包中的coxph函数。并对9个免疫相关基因进行多因素cox回归模型的构建，即TMBPI = Ʃ(βi × Expi) (i=9)。将病人分成高得分和低得分两组并利用logRank检验计算显著性p值。

结果

1. ccRCC病人的突变图谱

作者从TCGA下载339个ccRCC病人的突变谱，利用maftool包对突变数据进行可视化（图1）。

 图1. ccRCC病人突变图谱

这些突变根据不同的类型进一步分类，其中错义突变占大部分（图2A），且单核苷酸多态性比插入或缺失发生的频率更高（图2B），并且C> T的突变最多（图2C）。此外，我们计算了每个样品中碱基改变的数目，不同的颜色表示不同的突变类型的比例（图2D，E）。并展示了ccRCC中排名前10位的突变基因，包括VHL，PBRM1等（图2F）。且存在着互斥和共出现的突变（图2G），其中绿色代表共现，红色代表相互排斥。 

 图2.突变信息的统计汇总

2. TMB与生存结果，病理分期和肿瘤等级相关

计算336个ccRCC病人每百万碱基突变事件的数量作为TMB，然后将中位数TMB用作临界值，将患者进一步分为高和低TMB水平的两组。较高TMB组的患者的生存结果相比更差（图3A）。且高低组之间其他临床特征存在一定的关联（图3B-F）

 图3. TMB与预后及与临床特征的关系

3. 低和高TMB组之间的基因表达谱比较

heatmap表明，高TMB组中的基因通常比低TMB组中的基因表达水平低（图4A）。差异分析显示了1,265个DEG的（图4B）。并对差异基因进行GO富集分析（图4C）。且选择了与TMB相关的条目进行展示（图4D）。由于TMB与ccRCC中的免疫信号或途径相关，因此从Immport数据库中提取19个与免疫相关的基因，对它们进行后续分析（表1）。

 图4. 低和高TMB样品中基因表达谱的比较

表1.19个免疫相关基因

4. 突变与免疫浸润的关联

对基因进行生存分析，以筛选与生存高度相关的6个预后免疫基因。IL20B，CRP和DNASE1的较高表达水平与不良的生存结果呈正相关，而KIT，MAL和PLCG2的表达水平与预后呈负相关（图5）。进一步利用TIMER数据库评估了这些基因突变与ccRCC微环境中免疫浸润的潜在关系（图6）。

 图5. 6个TMB相关基因进行生存分析。

 图6. 6种中心TMB相关基因的突变与免疫细胞浸润的关联

5. 低和高TMB组中免疫细胞的丰度的差异

使用“CIBERSORT”过滤P>0.05的样品，选择238个样品进行免疫细胞分析，包括121个低TMB样品和117个高TMB样品（图7A）。此外，Wilcoxon秩和检验显示高TMB组的CD8+ T细胞等的浸润水平低于低TMB组（图7B）。 

图7. 低TMB组和高TMB组之间22个重要免疫比例的比较

6. 低CD8 + T细胞和巨噬细胞浸润伴随不良的预后

在ccRCC样本中进一步进行了Cox回归模型，Surv(KIRC) ~ B cell + CD8+ T cell + Macrophage + CD4+ T cell + Dendritic cell + Neutrophil cell，发现CD8+ T cell (HR =0.175, P=0.029) and Macrophage与生存有关。利用Kaplan-Meier分析，其中CD8 + T细胞和巨噬细胞的较低浸润水平确实与ccRCC的不良生存结果相关（图8A）。

7. ccRCC的TMBPI的构建和评估

基于以上分析结论，免疫特征的改变会导致较低的免疫浸润和不良预后，基于多因素Cox回归模型，将TMBPI构造如下：PI =（0.042086×CRP + 0.347889×DNASE1 + 0.118190×IL20RB − 0.027266×KIT − 0.007359×MAL − 0.256051×PLCG2）。然后，我们计算了每位ccRCC患者的TMBPI，并将其分为高（n = 265）和低风险水平（n = 265），绘制3年OS预测的ROC曲线（AUC = 0.666，图8B）。同时，KM曲线显示，高TMBPI的患者显示出较差的生存结（图8C）。

 图8.两个TMB组中差异免疫细胞的生存分析

今天的分享到这里主要内容就介绍完了，文章思路清晰，结合浸润和TMB对肾透明细胞癌预后做了详细的分析，算是TMB预后加强版了，还是很值得借鉴的。疫情慢慢好转，大家也不要放松警惕，好好保重身体健康的搞科研哦！