什么是Repli-seq？
最近接触到一个新的测序method：Repli-seq！这篇笔记就是为了学习和思考浅层思考Repli-seq
文章题目：Sequencing newly replicated DNA reveals widespread plasticity in human replication timing
1：什么是Repli-seq？能解决什么问题呢？
真核细胞的细胞周期中，母细胞复制它们的染色体，并将复制的基因组分离到它们的子细胞。在DNA进行复制的过程中，遗传信息的传递是非常重要的（在表观上也非常重要）。
伴随着DNA的复制，会有父链和子链的生成。但是尚不知道人类复制程序在不同细胞类型之间变化的程度，以及这种变异与人染色质的结构和可及性之间的关系。
从Taylor等人使用氚化胸苷可视化脱氧核糖核酸复制【1】的实验开始，动物细胞中的复制被组织成具有相似复制时间的离散区域，由多个复制起点及其相关复制子组成，复制子的大小从30 kb到450 kb不等。【2】（理解一下， DNA的复制是半不连续半保留复制）
DNA复制过程
既然有非常多的复制子区域散布在基因组中，现在具有一个问题，是不是DNA在复制的过程中，会有很多的复制区域会发生同时复制？我们都知道在细胞分裂的过程中，DNA复制发生在细胞间期。细胞间期分为：G1,S,G2期；而DNA在复制发生在S期。
在DNA发生复制的时候，有很多Replication time zones ，它们在复制的时候是非常保守的。而复制条带在不同细胞类型之间似乎非常相似，这暗示了对不同人类细胞，不同发育谱系中复制程序的基本相似性。但是在复制的时候，还是有一部分存在复制时间的弹性。（不同的DNA复制的时期不一样，有复制早期和复制晚期）
除此之外，复制时间（replication timeing）是除了细胞复制功能的一个重要表观遗传组成部分。在细胞传代的过程中，很多表观信息也是被忠实的传递的。
为了全面定义人类细胞中的DNA复制程序，探讨其对基因组组织和高级转录调控的重要性。使用大规模平行测序（Repli-Seq）将DNA复制时间定量为基因组复制起始位置，并应用它来定义包括未分化胚胎干细胞（hESC）在内的多种人类细胞谱系的“复制体”。分析表明，至少50%的人类基因组表现出DNA复制时间呈现出组织特异性变异。
2：Repli-seq具体怎么实现的？
首先，它利用一种sequece-tagged sites (STS 序列标记位点)markers,对新生的链（子链）进行标记。用5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU）在体内标记新合成的DNA链，它的原理是在新的复制DNA中替代胸腺嘧啶。然后，将标记的细胞分为六个部分，这些部分跨越细胞分裂的所有DNA合成阶段（G1b，S1，S2，S3，S4和G2）。然后用BrdU抗体去拉DNA下来，然后进行测序。
图一：Repli-seq approach
这个图表达的是，在正常淋巴母细胞样细胞系（LCL）中，新合成的DNA的细胞周期分级分离。 用BrdU标记指数生长的细胞，用DAPI染色，并根据DNA含量分选到细胞周期的不同部分，如该正常淋巴母细胞样细胞系（LCL）所示。 分选在整个细胞周期中是连续的。
图二：特定的基因的在复制过程中富集的情况
图二是淋巴特异性LRMP基因的早期的复制峰。 在50kb窗口上计算每个细胞周期分数的序列标签密度，根据其全基因组序列标签计数进行标准化，并通过计算总复制百分比在每个基因组位置进一步标准化。
3：使用基于PCR的复制时序验证Repli-Seq
为了确认Repli-Seq提供的复制模式与使用常规STS标记和基于PCR的分析获得的复制模式相同，采用了分析B淋巴细胞和K562细胞的β-globin locus进行分析。因为在B淋巴细胞中这个基因转录沉默，但是K562细胞系中，它转录活跃。
k562细胞和淋巴细胞的β-globin的复制情况
在细胞间期的G1,S1,S2时期，能看到β-globin在K562细胞中看到复制带。但是在淋巴细胞中，S3,S4,G2时期，我们能看到β-globin的复制带。说明转录时期是不同的。那么Repli-seq的数据是否和它是一致的呢?
repli-seq数据的结果
从repli-seq的数据来看，说明和PCR的数据是匹配的上的。
4：不同细胞谱系的Repli-Seq验证
在人的成纤维细胞（BJ），hESCs（BG02）和LCL（TL010）还通过将Repli-Seq重新应用于来自新的成纤维细胞来证实了其高重现性。根据观察到每种细胞类型的数据，发现了一些独特的谱系模式。
不同细胞谱系的验证
我们观察了每种细胞类型，以显示独特的全基因组复制时序曲线，发现有很多“恒定”结构域（在细胞谱系中峰都比较稳定），而有一些区域被称为“可塑”结构域，是细胞特异性的标志（图三B）。此外，在图四中， 还确定了几种区域复制时间的恒定型模式还有一些可塑性的模式图。我们发现，当对四种不同的细胞谱系进行比较时，人类基因组中有49%具有复制时间可塑性！
图四：“恒定”，“可塑”的结构repli-seq图
5：对peak进行注释
早期恒定复制（P <0.05）显著的区域与高基因密度，基因表达，Alu密度，GC含量，CpG密度，恒定早期区域也缺少L1-LINE和卫星序列（重复序列），而恒定晚期区域富含这些特征！
接下来进行replication time分类，把它分为“恒定”早期，晚期，可塑期。
发现了
图五 peak的分析
许多这些基因组特征在具有复制可塑性的区域中是可变的，基因含量与基因组的其余部分相比减少了30％，CG含量和Alu的含量比较少。该观察结果表明，晚期复制区域通常不仅定义了受抑制的区域，而且还定义了物理隔离的核区室。
图六 replication time分类
5：Replication Time和基因表达和染色体的结构
谱系特异性基因的表达和replication timing一致（就是转录活性比较高的区域，和早期replication timing相一致） 。接下来进一步的思考，染色质开放程度（高级结构）和基因的转录表达高度相关，染色质的结构和replication timing是否有关呢？为了寻找相关性，他们用DnaseI去切染色体，如果染色质比较松散的话是可以切的开的。如果染色质结构比较致密，则切不开。说明在转录，复制和染色质的高级结构上有一定的相关性。
图六 复制时间和基因表达的情况
6：双向复制时序
发现具有可塑复制的复制时序区域是一类双相复制域。 在雌性GM06990 LCL中沿着X染色体看到许多这样的区域。如何去理解这种双向的replication timing呢？
图七 五种细胞中X染色体的的峰图
作者解释到在女性中，X染色体有随机失活的情况。
图八 双向replication timing的情况
除了X染色体会发生这种情况以外，某些印迹域也可能会出现复制异步现象。 在hESC细胞中，15号染色体上的2 Mb Prader-Willi区域（G1和G2）发现的极端双相复制对具有细胞特异性（图九），除此之外，全基因组上还有一些其他的区域也存在类似的现象。
图九 hESC的 双向复制的情况
最后上一张workflow：
Repli-seq workflow
图片来自：https://www.illumina.com/science/sequencing-method-explorer/kits-and-arrays/repli-seq.html
Ref：
1：THE ORGANIZATION AND DUPLICATION OF CHROMOSOMES AS REVEALED BY AUTORADIOGRAPHIC STUDIES USING TRITIUM-LABELED THYMIDINEE. Taylor JH, Woods PS, Hughes WL Proc Natl Acad Sci U S A. 1957 Jan 15; 43(1):122-8.
2：Replication in context: dynamic regulation of DNA replication patterns in metazoans. Aladjem MI Nat Rev Genet. 2007 Aug; 8(8):588-600.
