2021-03-21-FOXA1突变揭示了不同的染色质谱并影响乳
FOXA1Mutations Reveal Distinct Chromatin Profilesand Influence Therapeutic Response in Breast Cancer（cancer cell
）
思路：FOXA1在乳腺癌中的突变概述（数量，类型，与临床治疗的关联）→FOXA1降低了AIs治疗效果→FOXA1Wing2突变在雌激素缺乏的情况下提供了生长优势→
→FOXA1Wing2突变通过增加ER位点的占有率诱导雌激素反应增强：在DMSO（缺乏雌激素）、雌激素（E2）、全培养基染色质条件下的ETFOXA1、wing2突变、SY242CS FOXA1之间的FOXA1——chip-seq差异
→FOXA1SY242CS驱动的构想变化有特定基序介导的转录变体，转录活性被取消，表现出特异的转录组特性，及特异性功能
摘要
①先驱转录因子FOXA1的突变是雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌的标志。
②通过对5000名乳腺癌患者的FOXA1检测，确定了Wing2区域的几个热点突变和位于第三区的一个乳腺癌特异性突变SY242CS。
③通过临床基因组学研究，结合乳腺癌模型，我们发现FOXA1基因突变与芳香化酶抑制剂的低反应相关。
④机制上，Wing2突变显示雌激素刺激后ER位点上的染色质结合增加，并且ER介导的转录增强而不改变染色质可及性。
⑤SY242CS显示出新的特性，包括能够打开不同的染色质区域和激活另一个顺式染色体组和转录组。
⑥结构模型预测SY242CS赋予一个构象变化，介导稳定的结合到一个非化学DNA基序。
介绍
①这些综合性研究将特定的基因改变与不同的乳腺癌亚型联系起来。例如，ER阳性（ER+）中的pIK3突变富集，ER2+中的ERBB2扩增，以及三阴性乳腺癌中的TP53突变和pTenloss。
②FOXA1被描述为一种先锋因子，它能与染色质结合，从而使其他转录因子重新加入到DNA中
③由于与连接组蛋白h1的结构相似，FOXA1可以取代连接组蛋白，以维持增强子核小体可供其他转录因子结合
④FOXA1突变的功能后果以及它们是否影响乳腺癌的进展和内分泌治疗的治疗反应目前尚不清楚。
⑤我们采用了一种全面的方法来研究全基因组染色质募集，染色质可及性，以及在乳腺癌模型中反复出现FOXA1突变的转录网络。
结果
一、FOXA1错义突变在转移性肿瘤中富集，并与较差的外切芳香化酶抑制剂（Aromatase Inhibitors）相关
①我们首先使用我们机构的队列研究了乳腺癌中FOXA1突变的患病率（分析时n=4952，www.cbioportal.org), 其中，超过400个癌症相关基因的基因组改变数据是通过食品和药物管理局批准的可操作癌症基因（MSK-IMPACT）平台（Cheng等人。，Foxa1突变发生率在所有患者中为4.18%，在转移性肿瘤中为4.88%（图1A）。
②这些突变大多定位于C末端叉头结构域（FKHD）（图1B），③该结构域由三个螺旋（H1-3）、三个B序列和两个环组成（“Wing1”和“Wing2”，图1C）
④利用1756例乳腺癌患者1918例肿瘤的详细临床注释，包括受体状态、治疗史和来自MSK-IMPACT的基因组改变数据（Razavi et al.，2018；Zehir et al.，2017），我们证实发现FOXA1突变在Wing2亚区富集（残基247–269，图1D
⑤PI3K催化亚单位IK3CA的热点突变在FOXA1改变的病例中也显著富集（图1e）
⑥在不同的FOXA1改变中，错义取代是最常见的（图1F，绿色和黄色）
⑦鉴于FOXA1热点和ESR1突变之间的相互排斥性，我们接下来研究了乳腺癌中FOXA1突变的存在是否与抗雌激素治疗后的临床结果相关。
筛选了接受单剂内分泌治疗的患者。我们的分析包括17名在芳香化酶抑制剂（AI）治疗开始前收集的肿瘤样本中有错失Foxa1突变的转移性乳腺癌患者和287名治疗前有Foxa1野生型（WT）肿瘤的转移性乳腺癌患者作为对照。
与WTFOXA1患者相比，携带FOXA1错义突变的患者无进展生存期（PFS）显著缩短(图1G)
总之，这些数据表明FOXA1突变与对AIs(aromatase inhibitor)的低反应有关
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二、FOXA1Wing2突变在雌激素缺乏的情况下提供了生长优势
①我们重点研究了FKHD C端的错义突变，因为它们在乳腺癌患者中的发生率相对较高，并预测了功能结果(www.cbioportal.org)（图1B）
突变改变了转录活性
突变导致与DNA的结合改变
②虽然大多数突变保留了WT FOXA1和DNA之间的典型相互作用，但一些突变导致结构改变（图2a和图2b）。
③为了研究FOxA1muta对ER+乳腺癌生长的生物学影响，我们构建了表达V5-taggedFOXA1变体和对照品系的MCF7ER+乳腺癌细胞系（图2B）
④当进行二维生长测定时，在全培养条件下的不同突变体中未检测到生长变化；然而，当细胞在雌激素缺乏的条件下生长时，与WT FOXA1对照细胞相比，一些FOXA1突变体显示出生长优势
⑤具体来说，在没有雌激素的情况下，Wing2的突变赋予了增殖能力的最高增益。在MCF7和T47D细胞中进行低密度实验，测量病灶数量和病灶面积，发现最常复发的Ntoxa1突变（图2D、2E和S2D），并在MCF7细胞中进行非锚定（图2F）生长分析，证实了这些结果
⑥此外，在体内进一步观察到SY242CS和F266L在“雌激素低”条件下的生长优势，在小鼠体内去除雌激素颗粒后，表达这些突变体的异种移植物继续生长，使血清中的雌激素水平恢复到基础状态（图2G，右图，以及S2E和S2F）值得注意的是，在雌激素颗粒的存在下，SY242CS也显示出温和的生长优势（图2G，左图）
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三、FOXA1Wing2突变通过增加ER位点的占有率诱导雌激素反应增强
①为了明确FOX11突变在基因组宽染色质结合中的作用，我们在MCF7ER+乳腺癌细胞中进行染色质免疫沉淀序列（ChIP seq）研究，表达Fox1基因的变化。根据频率和功能结果（图1和图2），我们选择了四个突变：Wing2中三个最经常发生的突变（H247Y、S250F和F266L）和一个影响DNA接触残基的Wing2外部突变
②为了确定FOXA1突变是否影响ER-FOXA1共享顺反子组，我们在雌激素缺乏条件（DMSO）、雌激素（E2）诱导和全培养基（FM）条件下构建了芯片序列。尽管所有样本显示出相似的基因组特征分布（图S3A），但在雌激素刺激下，与WTFOXA1相比，Wing2突变体FOXA1抑制了更强的结合。相反，在FM条件下，SY242CS FOXA1显示出与WT FOXA1相比最高的差异峰数（图S3B）。为了描述由这些突变驱动的顺反式改变，用无监督聚类分析法分析动态峰。我们获得了总共59620个峰的图谱，其中15819个动态峰分布在7个簇中，并显示出相似的基因组分布（35%的基因间区、50%的内含子区、4%的外显子区、2%的UTR区和8%的启动子区）（图3a和3B）
③我们的芯片序列数据的k均值聚类分析突出了一组雌激素反应峰，占总动态峰的13.24%（聚类6；图3C）
④为了分离每个簇，我们进行了Homer de Novo motif分析（Heinz-Metal.，2010）。虽然大多数cluster显示FOXA1结合基序（FKH）有明显的富集作用，簇6重新形成“核受体”，作为最显著的富集基序AcrossFoxA1突变位点，特别是那些影响Wing2区域的位点（图3和图S3C），暗示了Wing2突变体与ER位点的结合增加。
⑤将公开的FOXA1芯片序列数据与我们的数据集相结合，证实了我们的峰值是FOXA1特异性的。同样，公开的ER芯片序列数据证实了ER全基因组占用率与FOXA1突变位点簇6高度重叠（90%）（图3F和3G）。
⑥与这一观察结果一致，Wing2 FOXA1突变体在典型内质网靶基因Tff1和GfBp4上表现出与E2诱导的结合增强（图3H）。
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四、FOXA1基因突变诱导雌激素反应增强
① 为了阐明由FOXA1改变驱动的特异性顺式细胞变化对转录组学的影响，我们对表达不同突变的细胞进行了RNA测序（RNA-seq）。总的来说，基于k均值的聚类显示，与WTFOXA1相比，Wing2突变保留了E2依赖的转录程序，这是值得注意的nRNA-seqcluster3（图S4A）。与观察到的顺反式变化一致，基因集富集分析（GSEA）确定了三个Wing2变异体中雌激素反应始终富集的途径。
②FOXA1热点突变与ESR1突变相互排斥（图1E）
③我们观察到，大多数SR1突变基因sig性质显著重叠，并与Wing2突变体（F266L、S250F和H247Y）基因标志呈正相关（图4B、S4E）
④我们将我们的FOXA1突变体和代表性突变体Y537S的顺反转录数据与WTESR1重叠（Jeselsohn等人，2018）。我们确认WTESR1在FOXA1簇6处的结合最为强烈（图4C），这与我们之前的数据（图3F）一致。
⑤我们观察到在缺乏激素的培养基中或E2上的突变体Y537S顺反子在FOXA1突变体的簇6上表现出明显的结合。特别是，90%以上的FOXA1突变体结合在cluster6与Y537S ER突变体结合重叠（图4D）。
⑥V5芯片序列验证F266L-FOXA1 与野生型FOXA1相比，在这些位点上增强了与E2的结合，并在这些位点上具有FKH和核受体富集基序（4E）
这些峰也与Foxa1芯片序列簇6高度重叠（图4G）
我们的研究结果表明，雌激素反应的激活是FOXA2 WIN2突变诱导内分泌治疗抵抗的潜在机制。
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五、FOXA1SY242CS驱动的构象变化导致非标准DNA结合基序、顺式组和转录组
①与野生型FOXA1相比，簇4代表了一个独特的SY242CS特异性染色体组，与Y242Cs获得的数千个新结合位点相比，无论雌激素刺激如何（图5A）
②我们鉴定了SY242CS FOXA1的3663个能在基因水平观测到的dynamic峰，例如EFEMP1、FST。
③为了确定该基序的特异性和活性，我们还设计了一个包含new ttattta基序的荧光素酶报告子，该基序代表6次串联和一个非结合对照（TTTATGTA）。在所有测试的变体（WTF和F266L作为对照）中，SY242CS突变体是唯一一个显著诱导由特定基序介导的转录的变体（图5C）
④正如预期的那样，当该基序发生突变时，转录报告活性被取消。WT或SY242CS-FOXA1与新基序TTTATTTA结合的结构模型表明SY242CS发生了WT-FOXA1所未见的整合性变化，这可能导致DNA结合的改变和/或与辅因子的差异相互作用。在我们的模型中，K240与来自新DNA基序的胸腺嘧啶（T）紧密相互作用（图5D）
⑤与Wing2Foxa1突变对SR1突变的正富集相比，FOXA1SY242CS突变体的转录组特征与所有三种培养基中的大多数突变体特征呈负相关（图5E）
⑥与WT FOXA1相比，FOXA1SY242Cs的表达导致更大类器官的形成（图5FandS5L），表明SY242CS诱导的生长增强。
⑦此外，在我们的MSK-IMPACT患者群中，我们观察到影响S242的突变具有组织学特异性，仅发生在导管癌中，而Wing2突变在导管癌和小叶癌中均增加（图5G）
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六、FOXA1SY242CS为非规范基序（Non-canonical）开辟了新的富集位点
①我们接下来进行转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）分析，以评估由FOXA1变体在MSO、E2和FM条件下引起的全基因组染色质可及性变化。基于k均值的聚类在差异可及区域上确定了8个簇。在与Chip-seq揭示的全基因组结合变化相反，我们没有观察到任何雌激素诱导的ATAC-seq簇（图6A）
②这表明，在E2刺激下，Wing2突变可能为FOXA1在ER位点的结合提供更高的亲和力，而与WT FOXA1相比，它们可能没有可能在相同的结合位点增加染色质开放性。相反，我们发现了一个SY242CS特异的ATAC-seq簇6，它占总动态峰的24.5%（图6B）。与先前观察到的SY242CS介导的顺反式改变一致（图3B）。
③重要的是，对该簇进行homer de novo motif分析（Heinz et al.，2010）得到了先前在ChIP seq簇4中鉴定为顶部富集基序的相同基序TTTA/GTTTA/G，进一步支持变异体FOXA1 SY242CS蛋白在染色质环境中获得改变的DNA结合位点特异性（图6C）
④FOXA1 chip-seq数据与ATAC序列簇的集成进一步验证了FOXA1占有率的特异性（图6D）
⑤同样，我们使用每个符合AP1的子单位（FOS、JUN和JUND）以及TFsGATA3、ER、TEAD4、AP2g和GRHL1（Xu等人，2020年）的可用公共芯片序列数据，验证了FOXA1结合位点的AP1复合物招募程度（图6d–6I）
⑥在SY242CS特定芯片seq集群（集群4）中，染色质可访问性的增益比WT FOXA1（图6J）强
⑦这表明富含新基序的增强结合位点具有更强的功能结果，并提示FOXA1 SY242CS突变体选择性地靶向替代位点结合和开放不受WT FOXA1影响的染色质的机制。事实上，近一半的SY242CS获得了结合位点，也显示了SY242CS特异性增加了染色质可及性（图6K）
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七、FOXA1SY242CS促进突变转录组的表达
①接下来，我们进行了一项广泛的分析，整合RNA-seq、ChIP-seq和ATAC-seq，以代表前50SY242CS上调基因的表达，这也显示了染色质可及性和染色质结合pro文件的高度增加。我们发现，在大多数前50个上调基因中，我们观察到多个获得的可访问位点以及增强的FOXA1 SY242CS结合亲和力（图7A和7B）
②对整合后的特定基因进行的基因组追踪分析显示，mRNA水平的增加伴随着gained ChIP-seq和ATAC-seq峰（图7C和7D）
③在表达SY242CS突变体和MCF7 KI SY242CS细胞后，通过实时定量聚合酶链反应分析在MCF7和T47D中验证这些基因的亚群，证实SY242CS而非WT的表达诱导了它们的表达（图7E、S7A和S7B
④综上所述，这些数据表明，当Oxa1-Wing2突变产生一个增强依赖性转录的FOXA1-ER协同调控网络时，SY242突变的获得为FOXA1提供了改变染色质不可接近性和激活独特顺式调节组的能力，进而触发另一个转录组（图7F）
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讨论
①我们对Oxa1+乳腺癌突变的全基因组研究揭示了突变Oxa1的非预期和独特的染色质可及性、染色质定位和转录谱，建立了两种表型群：一个超纯群一个是由Wing2突变驱动的，一种由乳腺癌特异性突变驱动的新病态基因，命名为Y242Cs
