细胞成脂诱导分化实验
成脂诱导
间充质干细胞具有分化潜能，在成脂诱导过程中，MSC会先分化成脂肪前体细胞，在诱导因子的刺激下最终分化为脂肪细胞，产生脂滴。脂肪滴经油红O染色后在显微镜下呈现显著的红色，未分化细胞则无明显颜色。
实验前期准备
1. 细胞状态：细胞增殖正常，形态正常，干细胞代次越靠前越好，3代左右进行诱导，但也不能太早，避免刚提取的干细胞中有杂细胞的存在。
2. 接种密度：细胞在80%左右进行传代，以3×10^4cells/c㎡接种，90-100%汇合度进行诱导。
3. 包被：0.1%明胶包被。
4. 试剂：4℃冰箱溶解和保存试剂。
配制时注意：部分试剂是醇溶，注意开盖时间，避免试剂挥发；试剂可分装，但不可以反复冻融。
成脂诱导步骤
1. 培养容器包被：0.1%明胶在培养箱中孵育30分钟。
成脂诱导过程对细胞刺激比较大，细胞容易飘，除了明胶，还可以用多聚赖氨酸或者血清进行包被。
2. 接种诱导细胞：取对数生长期的细胞，按照3×10^4cells/c㎡的细胞密度接种至包被后的培养器皿中，于37℃，5%CO₂培养环境下培养至汇合度90-100%，弃掉上清，加入入成脂诱导分化培养基诱导液（以下简称“诱导液”）。
正常组：加入完全培养基，诱导组：成脂诱导液。
如果细胞增殖很快，诱导起始密度就不要太密。
3. 细胞分化诱导：于37℃，5% CO₂培养环境下培养约3天，更换为成脂诱导分化培养基维持液（以下简称“”维持液），培养1天后，再更换为诱导液，继续培养3天。
按照以上换液频率诱导14-21天，并注意观察细胞形态变化。根据细胞诱导形成的脂滴数量和大小，决定终止细胞诱导的时间，并进行染色鉴定。
换液方式为全换；
诱导后期会看到细胞体积明显增大，内部有许多脂滴，此时应该结束诱导，避免脂滴汇合，由于没有支持的介质，脂滴会往上飘，细胞发生破裂。
4. 细胞固定：吸去培养基,使用适量1×PBS清洗一次，弃去后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面，室温固定30-60min，弃去固定液再使用1×PBS清洗两次。
5. 油红O染色：
油红O工作液配制：取生理盐水或1×PBS与油红O原液配制油红O工作液（油红O原液: 生理盐水=3:2），现用现配。
配制后对油红O工作液进行离心或者过滤，除去染液中的过饱和析出物。
染色：向清洗干净的诱导孔内加入适量工作液，静置染色30min；吸走油红O工作液，用1×PBS清洗两次，并加入适量1×PBS避免细胞干燥。
6. 诱导评估：显微镜下观察成脂染色效果，并进行图像采集和诱导评估；诱导成功时，脂滴会与油红O染料结合后呈现红色或橘红色。
一般在整个视野下，有30%的脂滴存在就是比较优秀的诱导结果了。
诱导过程注意要点
1. 培养基预热：培养基可分装，37℃水浴锅预热，预热的培养基贴壁加入孔板。
2. 分板接种：不确定诱导时间需要分板接种，通常用6/12孔板。
3. 调整时间：
（1）诱导液刺激脂滴形成，会损伤细胞，维持液维持脂滴，并促进脂滴融合，恢复细胞状态。当有小脂滴出现，可以换成维持液维持。
（2）诱导过程中，3天诱导液+1天维持液循环，根据细胞状态，可以调整为2天诱导液+1天维持液，若细胞状态不乐观，先用维持液维持。如果细胞状态非常差，可以直接换回普通完全培养基，待细胞状态恢复后继续诱导。
（3）尽量每天观察细胞状态，如果遇到周末不方便观察，可以在周五调整为维持液，周一换回诱导液，避免诱导液诱导超过3天。
4. 染色固定和拍照：
（1）固定液恢复至常温后固定细胞，轻柔加液，避免卷边。
（2）油红O是饱和溶液，不稳定，需要配制为工作液，再过滤。
（3）染色后尽快拍照，避免脂滴融合。
（4）拍照时需要留一点pbs浸泡，避免细胞干燥影响拍照。
常 见 问 题
1. 细胞状态差
诱导过程细胞膜碎裂或者碎化
（1）细胞聚团：控制细胞汇合度、明胶包被。
（2）细胞空泡，细胞部分不贴壁，死亡：诱导前细胞状态不佳，或诱导液刺激过大，需调整诱导时间。
2. 染色异常
（1）染不上色：诱导时间不够没有脂滴，脂滴少，误判为脂滴，诱导过度
① 可能是诱导时间不够：不同组织来源的MSC成脂效率不同，尤其是脐带干细胞，诱导时间超过30天，且脂滴不容易观察。
② 或者存在杂细胞或细胞不正确：所用细胞为新鲜提取的细胞，可能有杂细胞的存在导致诱导不成功。对于3t3-L1细胞成脂诱导，若细胞不正确，也诱导不成功。
③ 将圆形膨大的细胞误判为脂滴，没有脂滴当然染不上色。
④ 诱导过度，脂滴漂浮随换液丢失。
（2）染色后呈现一整片红色，可能是没有清洗干净。需要再次清洗。
（3）染色后红色在细胞表面：脂滴应在细胞内部，表面的红色不是脂滴。
（4）未调整白平衡。
3. 杂质：细胞代谢物，油红未过滤，或者诱导过程中发生污染。
诱导液的不溶物
