建立焦亡相关基因的模型，寻找治疗PAAD的潜在治疗靶点

System analysis based on the pyroptosis-related genes identifies GSDMC as a novel therapy target for pancreatic adenocarcinoma

基于细胞焦亡相关基因的系统分析确定GSDMC为胰腺癌的新型治疗靶点

发表期刊：J Transl Med

发表日期：2022 Oct 5

影响因子：8.440

DOI:  10.1186/s12967-022-03632-z

一、研究背景

        PAAD是一种以快速扩散和预后不良为特征的癌症肿瘤。研究表明，胰腺癌的发病率和死亡率几乎相等，大多数PAAD患者在被诊断时已经患有晚期疾病。然而，高达80%的胰腺癌因其高度恶性和早期转移而不能被切除。

        细胞焦亡是一种由炎症性caspases诱导的调节性坏死细胞死亡。它主要依靠炎症激活Caspase家族的一部分蛋白，使炎症裂解Gasdermin蛋白，激活Gasdermin蛋白，被激活的Gasdermin蛋白转运到细胞膜上形成孔洞，然后细胞膨胀，细胞膜破裂，最后导致细胞质外流，形成细胞焦亡。

二、材料与方法

1、数据来源

1） 从TCGA和GTEx数据库中下载了178份PAAD样本和167份正常胰腺样本的RNA测序（RNA-seq）数据及其临床病理参数

2） 186个PAAD样本的RNA-seq数据和临床病理特征从GEO  GSE71729和GSE57495数据集下载

在进一步分析之前，基因表达数据通过“Sanger box”工具进行标准化（http://sangerbox.com/）

2、分析流程

1）识别差异表达的细胞焦亡相关基因：使用"DESeq2 "软件包来识别PAAD样本和正常样本中差异表达的细胞焦亡相关基因；蛋白质相互作用（PPI）通过使用string进行绘制

2）差异表达的焦亡相关基因的富集分析：用GO和KEGG分析了25个差异表达基因的生物过程富集情况；进行了基因集富集分析（GSEA）

3）预后基因的鉴定：单变量Cox回归分析、LASSO Cox回归、在单变量Cox回归的基础上进行多变量Cox回归分析

4）基于细胞焦亡相关基因的预后模型的构建和验证：根据训练组中集中和标准化的PAAD mRNA表达数据，计算风险分数；利用GEO数据库中的PAAD队列进行了验证；单变量和多变量的Cox回归分析

5）nomogram和校准曲线的构建

6）药物敏感性分析：使用R软件中的pRRophetic包，计算高危组和低危组中每个患者的每个小分子化合物的敏感性得分；使用PubChem网站将药物的构象在三维中可视化

7）实验：细胞培养、CCK8检测、EdU测定、伤口愈合实验、蛋白印迹法、慢病毒的生产、感染和稳定细胞系的构建、细胞周期分析、细胞的化学处理

流程图

三、实验结果

01 - 构建基于训练集中细胞焦亡相关基因的预后模型

        作者从TCGA获得178名PAAD患者，从GTEx获得167个正常组织，从33个细胞焦亡相关基因中共识别出25个不同表达的细胞焦亡相关基因。在PAAD患者中，火山图、热图和箱线图显示，16个细胞焦亡相关基因明显下调，而9个细胞焦亡相关基因则上调（图2A，C，D）。这些差异表达的细胞焦亡相关基因的蛋白-蛋白相互作用网络显示在（图2B）。此外，在这些差异表达的细胞焦亡相关基因中，观察到PAAD患者的许多突变（图2E）。

图2 PAAD组织和正常组织之间的细胞焦亡相关基因的差异表达

        为了更好地了解不同表达的细胞焦亡相关基因的功能，进行了GO和KEGG通路富集分析。GO富集分析显示，这些差异表达的细胞焦亡相关基因主要与细胞因子产生的正式调节和对细菌的防御反应有关（图S1A）。此外，对KEGG的分析显示，这些差异表达的焦亡相关基因涉及铂类药物抗性、细胞凋亡-多物种、ERbB信号通路和细胞凋亡（图S1B）。这表明，这些焦亡相关基因除了参与细胞焦亡外，还参与其他生物过程。

图S1 GO和KEGG的功能富集分析

        如图3A所示，用单变量Cox回归分析筛选出9个细胞焦亡相关基因，包括5个潜在风险基因（IL18、GSDMC、NLRP2、CASP8和CASP4）和4个潜在保护基因（PLCG1、GPX4、PRKACA和NLRP1）。在单变量Cox回归的基础上，再进行LASSO回归分析（图3C，D）。接下来，用IL18、CASP4、NLRP1、NLRP2和GSDMC通过LASSO回归构建了预后的细胞焦亡相关模型。最后，进行了多变量的Cox回归分析，确定了三个与细胞焦亡相关的基因，其中两个是潜在的风险基因，一个是潜在的保护基因（图3B）。

图3 在TCGA队列中构建一个基于细胞焦亡相关基因的风险预后模型

        作者为所有的癌症样本构建了一个预后指数，计算公式为：风险分数=IL18的表达水平×0.002067+GSDMC的表达水平×0.034755+NLRP2的表达水平×0.028693+PLCG1的表达水平×（-0.00285）+NLRP1的表达水平×（-0.05665）+CASP4的表达水平×0.036385。为了证实这个与细胞焦亡有关的模型是否能预测PAAD患者的预后，根据中位风险评分的阈值将170名患者分为高风险组（n = 85）和低风险组（n = 85）（图4A）。与低风险组相比，高风险组的死亡率更高，生存时间更短。分数越高与PAAD患者的预后越差有关（图4C）。IL18、CASP4、GSDMC和NLRP2在高危组高表达，NLRP1在高危组低表达（图4D）。Kaplan Meier曲线显示，高危组患者的预后较差（图4B）。时间依赖性ROC分析显示，1年时OS的预后准确性为0.673，3年时为0.768，5年时为0.790（图4E）。

图4 在TCGA队列中构建风险模型

        为了验证所建立的预后模型的准确性，作者从GEO获得了186名胰腺癌患者，并使用训练集的相同公式计算风险得分。根据风险评分的中值，GEO队列中的99名患者被分为低风险组，87名患者被分为高风险组（图S2A）。低风险组的病人比高风险组的病人有更长的生存时间（图S2C）。IL18、CASP4、GSDMC和NLRP2在高危组高表达，NLRP1在高危组低表达（图S2D）。此外，Kaplan Meier分析也表明，低危组和高危组的生存率明显不同（图S2B），这与训练集的结果一致。时间依赖性ROC分析显示，OS的预后准确性在1年时为0.590，3年时为0.554，5年时为0.658（图S2）。

图S2 在测试组中验证与细胞焦亡有关的预后模型

02 - 风险分数和临床特征的独立预后分析，构建nomogram

        为了验证风险分数和临床特征是否可以作为独立的预后因素，进行了单变量和多变量的独立预后分析。单变量独立预后分析结果显示，年龄、N期和风险评分与PAAD患者的OS明显相关。多变量独立预后分析显示，风险评分可以是一个独立的预测因素。此外，评估了细胞焦亡相关基因的表达与临床特征之间的关系。结果显示，NLRP1与等级、N、T阶段呈负相关。NLRP2与等级呈正相关。GSDMC与分期呈负相关。CASP4与等级呈正相关。风险评分与等级呈正相关。基于这些研究结果，我们得出结论，模型可以成为一个可靠的预后生物标志物。

        为了给临床医生提供一个更好的定量方法来预测PAAD患者的预后，建立了一个结合年龄、性别、N、T和风险分数的nomogram，风险分数是各种临床参数中的一个重要因素（图5A）。此外，还构建了校准曲线，显示nomogram与PAAD患者的实际生存期有很好的匹配（图5B-D）。与传统的预后评分系统相比，模型具有更高的AUC值（图5E）。

图5 预测胰腺癌患者生存概率的nomogram

        作者还在训练组和验证组中分别对高危组和低危组进行了GSEA富集分析。在训练集中，结果显示，高危组的富集通路包括细胞凋亡、紧密连接、剪接体、轴突引导和自然杀伤细胞介导的细胞毒性。低风险组的主要富集途径是神经活性配体受体相互作用、味觉转导、自身免疫性甲状腺疾病、趋化因子信号通路、局灶粘附（图S5A）。在验证组中，结果表明主要的富集途径包括高风险组中的蛋白酶体、糖基磷脂酰肌醇GPI锚的生物合成、核苷酸切除修复、氨基酰tRNA的生物合成和DNA复制，而在低风险组中，主要的富集途径是心肌收缩、长期抑郁症、血管平滑肌收缩、钙信号通路和肌萎缩侧索硬化症ALS（图S5B）。

图S5 GSEA富集分析

03 - 药物与免疫分析

        为了预测化疗反应，作者使用pRRophetic算法，根据GDSC数据库中现有的PAAD患者的半最大抑制浓度（IC50）来估计化疗反应。共有49个小分子化合物在高风险组和低风险组之间有明显不同的反应。发现前四个小分子化合物在高危组和低危组之间的P值最低，包括A.443654（图6A），PD.173074（图6C），Epothilone.B（图6E），Lapatinib（图6G）。高危组的PAAD患者对A.443654、Epothilone.B和Lapatinib更敏感，而低危组患者对PD.173074更敏感。然后通过PubChem网站对这4个小分子化合物的三维构象进行了可视化（图6B、D、F、H）。鉴于这些发现，这些小分子化合物可能是潜在的PAAD治疗剂，但在不久的将来还需要进一步分析。

图6 筛选出的用于治疗PAAD的药物

        肿瘤微环境，包括免疫细胞和基质细胞，被认为在肿瘤的发展、转移、复发和耐药性中起着重要作用。因此，结合免疫评分、基质评分和ESTIMATE评分，分析这些评分与风险评分的关联。结果显示风险评分与免疫评分、基质评分和ESTIMATE评分（图7A-C）显著相关。使用CIBERSORT算法计算PAAD患者中22种亚型免疫细胞的比例（图7D），高危组的B细胞记忆、巨噬细胞M1和肥大细胞静止期的浸润水平高于低危组。然而，低风险组的B细胞Naive、T细胞CD8、单核细胞和肥大细胞激活的浸润水平高于高风险组（图7E）。此外，评估了风险评分和五种免疫细胞之间的相关性。结果表明，T细胞CD8，单核细胞，和B细胞Naive与风险评分呈正相关，而巨噬细胞M1和B细胞记忆与风险评分呈负相关。

图7 肿瘤微环境和免疫细胞浸润分析

04 - GSDMC相关实验

        为了研究GSDMC在PAAD细胞中的作用，设计了两个siRNA（GSDMC-1, GSDMC-2）来抑制GSDMC在PANC-1和CFPAC-1细胞中的表达。通过Western blot验证了GSDMC的表达，并发现上述两个siRNA能有效地敲除GSDMC的表达。Western blot显示，在PANC-1和CFPAC-1细胞中，用siRNA敲除GSDMC，减少了波形蛋白和Ki-67，但增加了E-cadherin表达（图8A）。根据这些结果，GSDMC可以促进PAAD细胞的增殖和侵袭。为了研究低表达的GSDMC对细胞增殖、侵袭、迁移的影响。对转染了Si-GSDMC-1或Si-GSDMC-2的CFPAC-1和PANC-1细胞分别进行了CCK8、菌落形成试验、EdU、Transwell和伤口愈合实验。CCK8结果显示，NC组的CFPAC-1细胞在24、48、72和96小时的增殖能力明显强于其他组（图8B）。通过肿瘤细胞集落形成实验，发现转染了Si-GSDMC-1或Si-GSDMC-2的CFPAC-1细胞的增殖能力明显低于NC组（图8D）。EdU染色实验结果显示，敲除GSDMC基因对CFPAC-1细胞的增殖影响明显，转染Si-GSDMC-1或Si-GSDMC-2的CFPAC-1细胞的增殖能力明显低于NC组（图8E）。转孔实验结果显示，没有GSDMC，限制了CFPAC-1细胞的迁移和侵袭。伤口愈合实验的结果显示，低表达的CFPAC-1细胞的迁移能力较低。该结果与CFPAC-1在PANC-1细胞系中的表现相似（图8C、F、H、I、K）。这些结果表明，敲除GSDMC的表达可以抑制PAAD的细胞增殖、迁移和侵袭。

图8 敲除GSDMC抑制了PAAD细胞的增殖和迁移

        为了测试细胞增殖和迁移的抑制是否由敲除GSDMC引起，使用慢病毒系统在PANC-1和CFPAC-1细胞中重新表达GSDMC（图S8A）。根据CCK8检测、EdU染色检测和克隆形成检测，我们发现，与GSDMC沉默的细胞相比，GSDMC沉默后的PANC-1和CFPAC-1细胞的细胞增殖和集落形成能力得到了一定程度的恢复（图S8B-H）。此外，与GSDMC沉默的细胞相比，GSDMC沉默后的PANC-1和CFPAC-1细胞的细胞侵袭和迁移也得到了一定程度的拯救（图S8G-K）。

图S8 恢复GSDMC可挽救GSDMC沉默诱导的细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用

        为了验证GSDMC在PAAD中的潜在作用，还进行了功能增益或功能丧失的分析。首先，在PANC-1和CFPAC-1细胞中过表达GSDMC，Ki-67和vimentin的表达明显增加，E-cadherin的表达明显减少，这表明过表达GSDMC可以促进PAAD细胞增殖和侵袭（图S9A）。使用CCK8试验测量细胞活力，以确定GSDMC对PAAD细胞增殖的影响。据观察，PANC-1和CFPAC-1细胞在转染GSDMC后，其生长曲线都有明显增加（图S9B，C）。与上述CCK8分析结果一致，GSDMC的过表达比对照组增加了更多的克隆数（图S9D，F）。在PANC-1和CFPAC-1细胞中，当GSDMC过表达时都显示出更高的EdU阳性染色（图S9E，H）。这些结果表明，由于GSDMC的上调，促进了PAAD细胞的增殖。此外，在转孔实验中，GSDMC的过表达明显增强了PANC-1和CFPAC-1细胞的侵袭能力（图S9G，I）。在伤口愈合实验中，PANC-1和CFPAC-1细胞的细胞迁移速度都得到了极大的促进（图S9J，K）。总之，这些结果表明，过量表达GSDMC会促进PAAD的细胞增殖、迁移和侵袭。

图S9 过量表达GSDMC促进PAAD的细胞增殖和侵袭

05 - A.443654抑制PAAD的细胞增殖

        为了研究A.443654对PAAD的潜在治疗作用，作者对PANC-1细胞系进行了CCK8检测、克隆形成检测、EdU染色检测和细胞周期分析。CCK8试验表明，用A.443654处理后，PANC-1细胞的细胞活力呈上升趋势（图S10A）。克隆形成试验表明，用A.443654处理后，PANC-1细胞的克隆数量明显减少（图S10B）。EdU结合试验表明，用A.443654处理后，PANC-1细胞的EdU阳性染色降低（图S10C）。细胞周期分析表明，用A.443654处理后，PAAD的细胞增殖可被抑制（图S10D，E）。总之，这些结果表明，A.443654可以抑制PAAD的细胞增殖。

图S10 A.443654抑制PAAD的细胞增殖

四、结论

        在这项研究中，作者建立了一个基于IL18、CASP4、NLRP1、NLRP2和GSDMC基因的预后模型，有效预测了PAAD患者的预后。结果表明，这些基因可以成为预测PAAD患者总体生存的潜在生物标志物。此外，体外实验的结果显示，GSDMC可以促进PAAD细胞的增殖、迁移和侵袭。