（上）Induced Pluripotent Stem Cell
由日本iPSC领域的大牛2019年发表在Physiological Reviews上的一篇综述：诱导多能干细胞及其在人类疾病和发育模型中的应用，系统性地梳理了从iPSC的起源到前沿应用的一系列重要事件，是入门了解诱导多能干细胞领域不可不读的文章
Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development | Physiological Reviews
以下为I 、II部分翻译（水平有限，仅供参考）：
摘要：
体细胞核移植的发现证明，体细胞可以携带与受精卵相同的遗传密码，激活该密码的部分足以将细胞重新编程到早期发育状态。近半个世纪后，诱导多能干细胞 (iPSC) 的发现为重编程提供了分子机制。iPSC 的最初创建是通过四种特定基因（OCT4、KLF4、SOX2 和 c-Myc；OSKM）的异位表达来完成的。此后，iPSCs 已从多种细胞类型和多种物种中获得，这表明了一种普遍的分子机制。此外，尽管 OSKM 仍然是黄金标准，但已使用多种方法将细胞重新编程为 iPSC。与其他多能干细胞相比，iPSC 的来源丰富；因此，越来越多地使用 iPSC 来模拟身体组织、器官和其他系统的发育。 iPSC 还通过对患者样本的重新编程，被用于疾病建模。此外，自第一份报告以来的 10 年里，人类 iPSCs 已经成为新的细胞疗法和药物发现的基础，并已达到临床应用。在这篇综述中，我们研究了 iPSC 的产生及其在疾病和发育中的应用。
一、重编程的历史
为了解释细胞如何携带遗传信息，1893 年，August Weismann 描述了他的遗传理论，即 Weismann 屏障(Weis-
mann barrier) (365)。该理论假设，由于遗传仅通过生殖细胞（卵子和精子）发生，并且由于其他体细胞不作为遗传介质，因此在特定状态的细胞中，不需要的遗传密码被删除或最终失活。半个多世纪后，Briggs 和 King (27) 表明，移植囊胚或原肠胚核的去核卵可以孵化正常的蝌蚪，但效率却大不相同，这导致他们提出细胞核随着发育而发生永久性变化(96)。在这些实验之后，Conrad Waddington通过将正常胚胎发育描述为滚下山坡的球来说明如何获得最终的分化状态（353）。为了逃离这个底部，细胞必须超过压倒性的引力势，有效地使细胞处于永久状态，这与魏斯曼的提议是一致的。然而不久之后，John Gurdon 爵士通过证明体细胞核移植 (SCNT) 可以克隆青蛙来挑战这一理论 (95, 97)。 SCNT 断言，体细胞不仅不会丢弃遗传密码，而且可以通过适当的操作重新激活密码。
几十年后，Martin John Evans、Matthew H. Kaufman 和 Gail R. Martin 建立了从植入前胚胎中得到的自我更新细胞系。这些细胞系具有在体内产生所有细胞类型的遗传发育能力 (77, 204)。这种特性更广为人知的是多能性，Gail R. Martin 命名为胚胎干细胞 (ESC) 的细胞已被证明对于基因工程哺乳动物的产生具有无价之宝，并改变了发育生物学的世界 (23, 61)。后来，两个研究团队表明，通过与 ESC 融合，体细胞，如成纤维细胞和 T 淋巴细胞，可以通过表观遗传重编程来表达多能性相关基因，如 OCT3/4 (53, 328)。这一事实表明，多能干细胞 (PSC) 具有将体细胞重编程为具有多能性的潜力。总体而言，这些具有里程碑意义的报告肯定了存在重编程因子，科学家可以利用这些因子控制任何细胞的多能性。
其他关于重编程因子存在的线索来自于哺乳动物细胞通过一个确定的转录因子直接转化细胞命运。在这里，互补DNA (cDNA)减法导致发现三个基因，主要表达在增殖的成肌细胞。其中一种肌源性分化1的异位表达就足以将小鼠成纤维细胞转化为表达肌球蛋白等代表性标记基因的成肌细胞(56)。这项研究提供了强有力的证据，证明转录因子，尤其是一组细胞特性的调控因子，可以改变细胞命运。
上述工作的结合导致了诱导多能干细胞(iPSCs)的重大发现，它在功能上表现类似于ESCs，但来源于体细胞。iPSCs在药物发现、疾病建模和再生医学等医学领域具有广阔的应用前景。事实上，在发现iPSCs仅仅10年多的时间里，iPSCs已经改变了科学和医学研究的进行方式。在这篇综述中，我们通过研究多种可以产生诱导多能干细胞的方法，诱导多能干细胞分化成不同细胞系，以及这种能力在人体发育、基于诱导多能干细胞的人类模型的建立以及基于诱导多能干细胞的临床治疗的进展来研究这一变化。最后，我们简要地讨论了为了最大限度地发挥iPSC的潜力还必须解决的科学问题。
二、重编程到iPSC
A. 通过确定的因子诱导多能性
SCNT 和 ESC 融合都可以将谱系定型细胞恢复到具有更高分化能力的状态。这些发现表明存在未定义的重编程因子，这些因子可以以表观遗传方式消除体细胞记忆。有助于受精卵或 ESC 身份的基因被认为在很大程度上负责重编程过程中特定转录网络的重建。为了筛选这些重编程因子，使用可扩展的 ESC 比使用受精卵更容易，因为前者是作为培养细胞系处理的。
我们团队中的两个人（Takahashi 和 Yamanaka）假设在 ESC 中特异性表达的基因有助于 ESC 的特征，例如分化和增殖的能力。我们还假设这些因子可以将分化的体细胞转化为 ESC 样细胞。使用计算机减法（silico subtraction），我们确定了在小鼠 ESC cDNA 库中富集的表达序列标签 (expressed-sequence tags， EST)。使用这些序列信息，我们获得了编码新基因的 cDNA 的全长序列，这些新基因是 ESC 和内细胞团多能性的基础 (216)。我们将这些 cDNA 命名为 ESC 相关转录本 (ESC-associated transcripts，ECAT)。
每个 ECAT 基因的分析使我们选择了 24 个基因作为候选重编程因子。我们准备了五个 6 孔板，其中放置了小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)。这些 MEF 携带由 Fbx15 启动子驱动的新霉素抗性基因，该启动子仅在多能性细胞中具有活性。每个候选基因的逆转录病毒转导在细胞中没有产生明显的变化，但令人惊讶的是，在所有 24 个基因都被转导的孔中进行新霉素筛选后，有 22 个克隆存活（图 1）。这些克隆类似于 ESC 的克隆，是它们成纤维细胞起源的影子。
因为不太可能需要所有 24 个因子才能生成 ESC 样细胞，所以我们接下来的目标是将候选因子减少到最少的重编程因子集。在那时，没有人知道 ESC 样细胞的产生需要多少因子。 24 个基因的总组合是无法控制的，但一种聪明的方法可以澄清这些基因中的哪些是多余的。通过从这组 24 个基因中去除 1 个因子，测试了 24 种组合的重编程。在仍然可以通过转导 23 个因子获得 ESC 样集落的情况下，第 24 个基因可以自信地从重编程所需的一组因子中排除。这一策略的效果出乎意料。第一轮实验将名单缩小到 10 个候选基因。第二轮实验表明，排除四种基因中的任何一种基因都可重复地抑制克隆的形成。测试这四种基因的所有组合证实，小鼠成纤维细胞中转录因子 OCT3/4、SOX2、KLF4 和 c-MYC（以下简称 OSKM）的过表达可以产生 ESC 样细胞或 iPSC（331）。
图 1. 在最初的诱导多能干细胞 (iPSC) 实验中，Takahashi 和 Yamanaka (331) 确定了 24 个用于将体细胞重编程为多能性状态的候选基因。在成纤维细胞的细胞核中异位表达这 24 个基因 (A) 将细胞状态重新编程为在形态和功能上类似 ESC 的状态。进一步的实验证实，24 个基因中只有 4 个的异位表达： OCT3/4、SOX2、KLF4 和 c-MYC 是重编程所必需的。 B：重编程的人成纤维细胞的 iPSC 集落的图片。 （B 经京都大学 iPS 细胞研究与应用中心许可发表。）
在成功生成小鼠 iPSC 后，我们证明了相同的四个因子足以生成人类 iPSC (329)。由 James Thomson 领导的一个小组几乎同时报告了人类 iPSCs 使用不同的四个因素 (395)。其中两个因子OCT3/4 和 SOX2是通用的，但另外两个因子 NANOG 和 LIN28不通用。自从这一发现以来，研究人员已经表明，将给定的体细胞类型重新编程为 iPSC 状态，能使细胞有可能成为体内基本上任何细胞类型。
B. 重编程机制
1. 重编程多细胞的多种方法
多年来，已经提出了许多模型来解释将细胞重新编程为多能状态的事件。该领域的分歧依然存在，但逐渐形成共识。
重编程细胞的分子事件框架对于推进 iPSC 技术至关重要。细胞重编程仍然效率低下，只有少数细胞成功完成了这一过程。最初，两个模型占主导地位，作为对低效率的解释(384)。一个是精英模型（elite model ）。在该模型中，只有存在于体细胞群中的精英细胞，例如祖细胞和干细胞，才能重编程为 iPSC。换言之，OSKM 对多能性的诱导导致体细胞培养物中小部分干/祖细胞群的扩增。一般来说，体细胞群通常是异质的并且包含体干细胞的一个子集（90）。然而，谱系追踪研究表明，iPSCs 可以由终末分化的细胞产生，例如 T 和 B 淋巴细胞、胰腺 β 细胞和表达白蛋白的肝细胞 (8, 103, 316)，这表明对诱导多能性敏感的细胞比例比精英模型大得多（图 2）。
图2. 在诱导多能干细胞（iPSCs）产生后，两种理论主导了对重编程的解释，包括效率低下的原因。在精英模型（顶部）中，只有一个细胞亚群（祖细胞等）易受重编程影响。在随机模型（底部）中，所有细胞都是易受影响的，但只有一小部分细胞完成了重编程。
第二个模型是随机模型（stochastic model）。在这里，OSKM 可以对所有被转导的体细胞进行重编程。然而，许多事件必须按顺序或并行发生才能成功完成重编程。因此，更多数量的细胞将启动重编程过程但没有最终完成它。相应的，重编程被分解为多个阶段，如果一个细胞未能完成任何一个阶段，那么整个重编程过程就会崩溃。重编程早期阶段的关键事件包括体细胞基因的抑制、间充质到上皮的转化 (176, 292)，以及从氧化磷酸化到糖酵解的代谢变化 (263, 399)。重编程的后期涉及多能性相关基因的激活，组织特异性转录因子和发育基因的抑制，以及高 CpG 启动子区域上 H3K4me3 和 H3K27me3 的二价甲基化。如果这些事件中的任何一个发生得不太理想，那么细胞成为 iPSC 的概率就会受到严重影响。例如，DNA 损伤和细胞凋亡等现象会破坏重编程 (11, 117, 146, 174, 202, 349)。
在重编程的早期阶段，OSKM 占据许多基因组位点来动态重塑染色质状态 (311)。结合区域包括确定体细胞特性的基因的增强子和启动子，OSKM 将使它们的表达失活。一般来说，表观遗传学在细胞重编程中具有重要作用。例如，组蛋白去乙酰化酶抑制剂促进 iPSC 的产生 (123, 178)。组蛋白 H3K9me3 是一种抑制性组蛋白标记，它覆盖了多能性所需的许多基因，并破坏了 OSKM 对这些基因的可及性 (311)。同样，抑制组蛋白甲基转移酶 DOT1L 可以充分替代 KLF4 和 c-Myc 用于成纤维细胞的重编程 (258)。总体而言，组蛋白标记的变化与重编程的不同阶段相关（271）。
多能性基因在早期的激活被认为是随机的，而在晚期的激活则是确定的。内源性 SOX2 的表达是晚期阶段的完成以及成功重编程的标志。 SOX2通过占据这些因子的靶位点与其他内源性多能性核心因子如Oct3/4和Nanog协同作用，从而在iPSCs中形成稳定的多能性通路。如果是这样，那么OSKM之外的因素应该能够重新编程，如果它们绑定到适当的位点，并稳定必要的通路。Jaenisch实验室通过将OSKM替换为下游靶点LIN28、SALL4、ESRRB和NANOG来生成小鼠iPSCs，证实了这一假设(28)。
2. 化学计量跷跷板模型（Stoichiometric see-saw model）
对于iPSC生成，OSKM(或等效因子)必须持续表达，至少直到细胞通过随机阶段，成为中间重编程。在小鼠中，在OSKM完全投入使用之前(小鼠OSKM转导后8 -12天)，中断OSKM的表达将导致iPSCs重编程失败，即使这些细胞已经开始表达阶段特异性胚胎抗原-1 (SSEA-1)，这是多能性和重编程的代表性标记(24,317)。
影响重编程成功率的还有OSKM表达的化学计量学(36,265,380)。一些研究已经报道了良好的OSKM化学计量学在多能性方面具有选择性优势。Jaenisch实验室制备了“次级”体细胞（ “secondary” somatic cells），即携带强力霉素（doxycycline）诱导的OSKM表达的细胞，显示出比正常体细胞更高的重编程效率(368)。增强OCT3/4表达但降低SOX2表达也能提高重编程效率(265,380)，调节KLF4表达也能提高重编程效率(154)(图3)。
图 3. A：细胞重编程被认为通过两个阶段发生，早期或随机阶段和晚期或确定阶段。 Sox2 的内源性表达被认为代表了转变点（虚线）（29）。当重编程因子被诱导时，大多数细胞会启动重编程，但很少有会最终完成它。在此期间，细胞被认为是部分重编程的。已发现完全重编程的概率取决于 Oct2 与 Sox2、Klf4 的同种型和其他因素的相对表达。与较短的亚型相比，使用较长的 KLF4 亚型将导致更少的细胞启动重编程，但会有更多的细胞完成重编程。 B：正在重新编程的外周血 (PB) 的一系列时间图像。从左至右，PB 细胞在重编程转导前、1 周后（部分重编程）、2 周后（完全重编程）和 4 周后。重编程需要 2 周，但需要额外 2 周的传代和评估来确认完成。
化学计量学的重要性可以用跷跷板模型(308,386)来解释。在重编程早期，OCT3/4激活中胚层基因表达，抑制外胚层基因表达。SOX2促进外胚层基因表达，降低中胚层基因表达。只有适当平衡这两种因子的表达才能将体细胞重新编程为诱导多能干细胞。另一方面，OSKM表达不利会使中间细胞偏离重编程过程(271,335)。OCT3/4高 、SOX2低的化学计量不仅对早期的异位表达很重要，而且对后期的内源性表达也很重要。在重编程后期，当转基因在重编程细胞中被沉默时，内源性OCT3/4被高度激活，其水平与ESCs相当，而SOX2的表达保持低水平(28,330)。在中间重编程细胞中，OCT3/4高、SOX2低表达导致中胚层特征。事实上，在小鼠和人类细胞重编程的后期已经观察到中胚层基因的短暂表达，并且对重编程的完成很重要(271,330)。
3. 瞬时重编程
由于重编程效率较低，对重编程机制的分析变得复杂，因为启动重编程的细胞是一个具有完全重编程和部分重编程细胞的异质性群体。细胞表面标记物例如小鼠的 SSEA-1 和人类的 TRA-1-60 被证明可以区分这两组（39、249、271、335）。完全重编程细胞的纯化使得高分辨率分析成为可能，这揭示了重要的重编程特异性事件。例如，重编程的细胞瞬时表达中内胚层基因，这些基因是位于植入后胚胎原始条纹中的细胞的标志物（330）。原始条纹是外胚层开始分化的区域。在人类细胞重编程的后期，观察到与植入前胚胎相关的基因的瞬时激活，例如 DPPA3、DNMT3L 和 miR-371 (33)。最近，人类内源性逆转录病毒 (HERV) 在 TRA-1-60 (+) 重编程细胞 (252) 中被瞬时过度激活，被发现在人类植入前胚胎中被重新激活。总体而言，无论细胞起源如何，重编程细胞似乎都处于原始条纹状状态。
C. iPS 细胞的获得
1. 方法
iPSC 获取的不确定性和低效率促使许多新的获得iPSC的方法产生了（表 1）。 iPSCs 的原始生成依赖于外源因子的瞬时表达。小鼠成纤维细胞重编程这些因子的表达需要 1 周（256），而人成纤维细胞重编程需要 2 周（197）。在此期间，转染的细胞处于中间重编程状态，在此期间它们增殖并在完全重编程和不完全重编程之间缓慢振荡（335）。最初获取iPSC的方法使用的是逆转录病毒（Lentivirus）载体，用于表达外源重编程因子 (331)。附着到细胞表面后，该载体将重编程基因引入受感染的细胞，并将其整合到宿主基因组中。基于慢病毒的载体具有相似的特性，但据报道具有更高的重编程效率和更少的变异性 (368, 395)。这些病毒系统实现的稳定基因组整合有利于因子高表达、持续表达和高效的 iPSC 生成。然而，虽然病毒转导对细胞重编程的基础研究很有用，但它与细胞移植疗法不相容，因为在重编程后存在转基因被重新激活的风险（254）。腺病毒（ Adenovirus）载体降低了这种风险，但不能达到与临床应用相适应的水平，并且重编程效率低（318）。仙台病毒（Sendai virus ）是单链RNA，在细胞核外进行复制，被认为是最安全的病毒方法(85,242)。
基于 DNA 的方法也被建立起来了。尽管每天转导编码重编程因子的质粒可以诱导 iPSCs (256)，但结合了 EBNA-1 和 OriP 序列这两种成分的来自 Epstein-Barr 病毒的游离质粒已显示出最大的希望 (394)。该质粒在转染人细胞后表达 EBNA-1 蛋白，然后识别 OriP 序列以诱导质粒的游离扩增。转座子是基于 DNA 的载体，在催化酶转座酶的帮助下整合到宿主基因组中。 PiggyBac 是最初从蜂窝蛾细胞中鉴定的转座子 (83)。它有两个位于两侧的倒置末端重复序列和一个用于整合的 TTAA 序列。尽管包含重编程因子的 PiggyBac 盒已整合到细胞中，但它们可以在 iPSC 建立后通过转座酶的第二次处理从宿主基因组中移除 (138, 371)。在大多数情况下，这种切除不会在基因组上留下任何足迹。因此 PiggyBac 被认为是一种非整合方法。
RNA 的直接传递也被证明能够诱导多能性（361）。在这里，修饰的核苷酸用于合成编码重编程因子的 RNA。这些修饰的 RNA 的重复转导已经从人类成纤维细胞和外周血中建立了 iPSC。由于转导的 RNA 通过干扰素途径诱导先天免疫反应，因此使用牛痘病毒的重组 B18R 蛋白将这种负面影响降至最低。这种方法被认为比基于 DNA 的方法（包括非整合方法）具有更低的致突变风险。也有报道用重组蛋白建立 iPSCs (151)。在这项技术中，重编程因子与细胞穿透肽融合以促进它们在细胞中的转导。
上述方法具有不同的重编程效率、技术难度和基因组整合性。根据 iPSC 的目的，判断使用哪种方法最好应该基于该技术的效率和安全性。基础研究对所选方法的限制要少得多，因为安全性不是问题。另一方面，对于临床应用，无论效率如何，安全都是最重要的。最初的重编程方法被禁止临床应用，因为逆转录病毒对 c-Myc 的稳定基因组整合增加了重编程细胞致瘤的可能。其他重编程因子可以降低致瘤性 (232)。理想情况下，外源重编程因子不会整合到染色体中。仙台病毒提供了这种可能性，DNA 载体（例如游离质粒）也提供了这种可能性 (241, 255)。最终，基于 RNA 或蛋白质的方法提供了最小的整合风险，并且已经建立了良好生产规范 (67)，但它们在技术上仍然存在困难 (280)。
2. 重编程因子
在OSKM中，Oct3/4、Sox2和Klf4作为维持ESC多能性的基因的正调节因子。它们还抑制促进分化的基因的表达。第四个因子c-Myc被证明对于重编程是不必要的，但它的加入显著提高了效率（232）。c-Myc在重编程机制激活多能调节因子之前发挥作用，其下调细胞身份基因并促进细胞代谢转化为一种ESC（313）。一直以来，其影响的是细胞增殖，而不是多能性（299）。
除了OSKM，一个相当长的因子集列表已被证明可以将细胞重编程为诱导多能干细胞。除了OSKM和前面提到的OCT3/4、SOX2、NANOG和LIN28组合(329、395)外，转录因子GLIS1(194)和NR5A2(108)可以分别替代c-Myc和OCT3/4, SALL4(343)可以显著提高效率。细胞增殖和凋亡相关因子cyclin D1(69)和TP53抑制(117)也可以作为c-Myc的替代品。研究表明，miRNA或控制miRNA合成的基因[miR-302 (7, 220)， miR-372(320)和Lin28(395)]和表观基因组修饰因子[Suv39h (258)， Wrd5(6)和Jhdm1a(357)]也能有效地进行重编程。作用于表观遗传学的小分子可以通过修饰DNA甲基化[5-aza-cytidine(213)和RG108(305)]、组蛋白乙酰化[丁酸钠(402)和trichostatin A(123)]或组蛋白甲基化[Neplanocin A(119)]来提高重编程效率。此外，对小化学物质的筛选发现了能够促进或取代重编程基因的化合物。例如，8-br-cAMPcAMP依赖的蛋白激酶激活剂，可促进人成纤维细胞重编程(358)。最后，转化生长因子 (TGF)-β 1 型受体抑制剂 ALK5可以通过激活 Nanog 表达来促进 iPSC 重编程而不是 Sox2 (125)。
3. 亲代细胞和物种
iPSCs 最初是从小鼠成纤维细胞中建立的，因为这些细胞易于处理、能大量增殖。然而，人类原代成纤维细胞的建立需要皮肤活检，这涉及侵入性外科手术和专业技能。因此人们开始寻求更容易获得的细胞来源。外周血细胞是一种理想的重编程细胞来源，iPSC 已从 T 细胞 (302)、B 细胞 (103)、造血干细胞 (187) 和纤维细胞中建立。 iPSCs 也可以从毛囊中分离的角质形成细胞 (197)、牙齿和脂肪组织中的间充质干细胞 (323)、骨髓细胞和尿液中的肾上皮细胞 (401) 中诱导得到。胚胎和胚胎外组织样脐带血和羊膜细胞已被重编程为 iPSC (34, 257)，胃和肝细胞 (8)、神经干细胞和祖细胞 (76) 以及黑色素细胞 (348) 也是如此。总之，身体中的所有细胞似乎都有可能成为 iPSC，但效率不同。在为研究目的选择原始细胞来源时值得考虑的一点是，即使在重新编程后，iPSCs 也可以保持部分原始表观遗传状态 (152)。虽然这种记忆可以通过长时间的培养来消除，但它会影响 iPSC 的分化能力。原始细胞类型也会影响基因传递方法的选择，因为它会影响基因传递的效率。
可用于生产 iPSC 的细胞，除了细胞类型的多样性之外还有物种的多样性。除了小鼠和人类，iPSCs 已经从多种哺乳动物中建立，包括猪 (78)、兔 (116)、猴子 (185)、山羊 (278)、马 (231)、牛 (322) 和其他动物，例如鸡肉和鱼 (283)。来自不同类别和物种的 iPSC 可以帮助我们了解发育、繁殖和其他生物现象的进化。此外， 还可以从高度濒危物种如北方白犀牛的成纤维细胞中获得iPSC (15)，这有助于保护或恢复这些物种 (295)。
4. iPSC 克隆的评估
通常，iPSC 的多能性通过基因表达、畸胎瘤形成和注入囊胚后嵌合体的产生来评估（图 4）。小鼠 iPSC 能形成具有生殖系能力的成体嵌合体，表明 iPSC 可以分化成胚胎中所有类型的成体体细胞和生殖系细胞 (197, 254, 369)。此外，小鼠iPSC被证明可以使用四倍体胚胎互补产生存活的“全iPSC”小鼠，这是多能性的最严格标准（20、142、400），但不允许对人类iPSC进行类似的测试。相反，它们的多能性可以通过多能性相关基因的表达来表示，如NANOG、OCT3/4和SOX2。体外和体内实验均可证实其向三个胚层的分化能力。多能性也可以通过注射到免疫缺陷动物体内后形成畸胎瘤来证实。
图 4. 诱导多能干细胞 (iPSC) 的多能性必须满足几个标准。这里显示的两个标准是产生嵌合小鼠的能力（左）和形成所有三个胚层的能力（畸胎瘤；右）。出于道德原因测试人类 iPSC 时不考虑嵌合体标准。
许多报告显示，iPSC系（122、166、182、235、246、286）之间的细胞行为不同。这些差异对细胞的临床和生物医学应用具有重要意义。最重要的特征之一是分化能力，尤其是在重编程期间和之后发生的异常DNA甲基化（63，314）。
另一个重要的决定因素是基因表达谱（45）。Hochedlinger团队比较了小鼠胚胎干细胞和iPSC的转录和表观遗传学特征，发现在印记Dlk1-Dio3基因簇中编码的基因的表达水平在这两种细胞类型之间是可区分的（314）。对嵌合体贡献较差的iPSC克隆也表现出Dlk1-Dio3基因簇的高甲基化。另一方面，具有正常甲基化Dlk-Dio3基因簇和Dlk1-Dio3簇中正常基因表达水平的iPSC克隆在注射到二倍体囊胚后能够产生更高程度的嵌合体，甚至在四倍体胚胎互补后产生可存活的“全iPSC”小鼠。该研究表明，表观遗传学特征影响小鼠iPSC的分化能力。同一组后来表明，添加抗坏血酸可以防止Dlk-Dio3基因簇中印记的丢失（315）。据报道，印记的丢失也发生在人类iPSC的重新编程过程中，并在传代过程中保持（114）。使用多个人类iPSC和ESC进行的全基因组DNA甲基化分析显示，人类iPSC中存在显著的表观遗传变异（19，182）。Nishino等人（245）报告称，在连续传代后，人类iPSC中异常的DNA甲基化减少。
Koyanagi Aoi等人（166）比较了人类iPSC和ESC细胞系的神经分化能力、基因表达谱和DNA甲基化谱，发现具有缺陷分化潜能的细胞系表现出几种基因的表达增加，包括HHLA1、ABHD12B和C4orf51，这些基因编码在人类内源性逆转录病毒的长末端重复序列中。他们的表观遗传学分析表明，这三个基因的长末端重复序列的基因组位点是低甲基化的。我们比较了30多个iPSC和ESC克隆，发现早期分化阶段（从PSC到造血前体细胞）的分化能力与胰岛素样生长因子2（IGF2）和内胚层分化相关基因的表达水平相关（246）。另一方面，晚期的分化能力（从造血前体细胞到红细胞、巨核细胞等）与重编程过程中获得的异常DNA甲基化数量有关。
由于iPSCs可以由各种类型的亲本细胞产生，因此推测这种多样性可能导致不同的表观遗传学特征。早期的报道试图阐明来自不同亲本细胞的iPSC系是否具有同等的细胞特征。Miura等人（217）从小鼠胚胎成纤维细胞、尾端成纤维细胞、肝细胞和胚胎干细胞通过拟胚体形成建立的iPSC中生成包含神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经球，发现尾端成纤维细胞iPSC的神经球包含更多未分化细胞。移植后，尾端成纤维细胞iPSC衍生的神经细胞形成畸胎瘤的倾向较高。这些数据表明，畸胎瘤形成的倾向因亲本细胞类型而异。
一些表观遗传特征是从原始细胞传递和维持的，这种现象被称为“表观遗传记忆”（152、153、182、251、272）。以往的研究表明，表观遗传记忆可以导致分化倾向的差异。Kim等人（152）比较了来自同一品系小鼠的体细胞来源的胚胎干细胞和iPSC，发现来自非造血来源的iPSC分化倾向较差。他们使用基于阵列的综合甲基化分析（CHARM）评估DNA甲基化谱，并确定造血转录因子的基因组位点在成纤维细胞-iPSC中显著高甲基化，而成纤维细胞特异性基因的基因组位点在血液-iPSC中高甲基化，表明表观遗传记忆影响分化（152）。此外，他们表明，甲基化图谱和分化倾向可以通过体外分化后的二次重编程或通过添加染色质修饰化合物来重置。Polo等人（272）在基因相同的背景下比较了从成纤维细胞、B细胞、骨髓源性粒细胞和骨骼肌前体建立的小鼠iPSC的体外分化能力、基因表达和表观遗传学特征。这些iPSC株系表现出可区分的表观遗传特征和分化能力。与B细胞相比，来自成纤维细胞的iPSC生成的造血细胞数量较少，来自粒细胞的iPSC比来自肌肉祖细胞的iPSC更有效地生成红细胞和巨噬细胞。经过长时间传代后，表观遗传学和分化能力的差异减弱。这些数据表明，在分化过程中重编程保留了表观遗传记忆并影响了细胞行为。该报告还显示，传代减少了 iPSC 转录和表观遗传谱中的克隆差异，表明多能性相关网络的缓慢巩固和供体细胞特异性基因网络的消除。
人类 iPSC 中的表观遗传记忆也有报道 (153, 251)。Kim等人(153) 比较了由新生儿脐带血细胞和包皮成纤维细胞产生的人类 iPSC，发现它们都在有限数量的基因位点上保留了表观遗传记忆，并且它们的分化倾向偏向于亲本细胞。他们还报告说，即使经过长时间的传代，表观遗传记忆也没有被抹去。
最后，据报道，个体遗传差异，例如单核苷酸多态性 (SNP)，也会导致基因表达的差异，并可能影响 PSC 的行为。例如，Kajiwara 等人(139) 报道来自不同供体的 iPSC 克隆在其对肝细胞的分化能力方面表现出差异。此外，虽然 SNP 和其他突变可以影响重编程，但重编程方法本身可以诱导从头拷贝数变异和癌性从头突变 (91, 124, 207)。这些变化在临床细胞疗法中是一个严重的风险，它们还可能损害疾病建模和药物发现的分化能力和细胞形态 (150)。
除核 DNA 外，重编程还会引起线粒体 DNA 的许多变化，这些变化可能会影响细胞功能。代谢变化对于重编程至关重要，而细胞干性本身在很大程度上依赖于新陈代谢 (80, 82)。在重编程到多能状态期间，体细胞会将它们的新陈代谢转化为类似于 ESC 的新陈代谢，而重编程的效率将取决于这种转化的效率 (263, 273)。重新编程的细胞还将降低线粒体 DNA 的拷贝数 (273, 350)，这和（与分化细胞相比）具有更少且不成熟线粒体的 PSC 一致。因为每个细胞都有多个线粒体，它的线粒体 DNA 通常是异质的（多种基因型）。通常，线粒体 DNA 中的突变比核 DNA 高出一个数量级，这表明它们的耐受性相对较好 (356)。然而，突变线粒体 DNA 的百分比与疾病风险相关 (284, 287)。因此，iPSC 克隆的选择应考虑异质性。Fujikura 等人（84）首先报道了具有线粒体DNA异质突变的患者细胞的重编程。有趣的是，他们发现与原始细胞相比，生物模态（bimodal） iPSC 群体具有更高频率突变或几乎无法检测的频率。这种通过重编程产生的生物模态效应已经在其他线粒体 DNA 突变中得到证实 (100, 158)。频率较高的群体可以随着传代次数的增加而被移除 (44, 81)。这种效应的原因尚不清楚，但可能是较高的频率降低了细胞的适应度。突变的频率似乎与分化细胞的分化效率和活力相对应，这在研究具有高代谢需求的细胞时可能需要特别关注 (44, 105)。
线粒体 DNA 突变的风险是否会影响生产 iPSC 的供体选择是一个有争议的问题。线粒体 DNA 突变随着年龄的增长而增加，但重编程本身会产生从头突变，同时由于生物模态效应实际上可以降低突变频率。最近的两项研究在选择供体时对年龄的考虑存在不同意见。 Mitalipov 小组报告说，原始细胞中线粒体 DNA 缺陷的频率随着年龄的增长而增加，而 Nelson 小组发现与重编程过程本身相比，这些突变在 iPSC 中是无关紧要的缺陷 (141, 269)。然而，在这两项研究中，过度突变损害了分化细胞的功能，表明应使用线粒体突变较少的 iPSC。
总之，iPSC 系中的基因组、表观基因组和转录变异会导致细胞行为的差异，尤其对分化产生影响。这些发现强调了建立产生和选择最佳iPSC克隆用于应用的方法的重要性，包括细胞治疗、疾病建模和药物发现。
5. 培养条件
培养方法是iPSC研究和应用的一个基本考虑因素。人类iPSCs通常是在饲养细胞中产生和维持的。而对于临床应用，无饲养层(Ff)和无异源(Xf) （feeder-free (Ff) and xeno-free (Xf)）培养条件是必要的(233)。
为了开发Ff-Xf iPSC培养方法，科学家们使用了不同的基质和培养基材料组合。Xu等人(375)首先展示了一种用于人类PSCs培养的Ff系统，其方法是用基质胶（Matrigel）取代MEF饲养层，基质胶本身是一种异种基质，并使用层粘连蛋白作为粘合剂。其他材料，如重组蛋白和合成聚合物也可以取代饲养层细胞(40,190,209,219,281)。使用人饲养层细胞和层粘连蛋白基质的Xf条件也被描述过(87,177)。Thomson团队报告了TeSR1，一类五种鸡尾酒培养基，作为第一个Ff-Xf系统，然后E8，一类八种鸡尾酒培养基，在Ff-Xf条件下与vibronectin一起培养PSCs(40,191)。包含细胞外基质蛋白纤连蛋白、玻连蛋白或层粘连蛋白可促进人 PSC 生长 (22, 43)。尤其是laminin-511，一种与 Ff 系统兼容的细胞粘附分子，支持人类 iPSC 的稳定培养 (281)。最近，发现层粘连蛋白 511 的较短活性片段，层粘连蛋白 511 E8 片段 (LN511E8) 可增加粘附并有效维持人类 ESC 和人类 iPSC (219)。与全长层粘连蛋白 511 (379) 相比，重组 LN511E8 蛋白 (rLN511E8) 更容易提取，产量和纯度更高。人类 iPSC 可以解离成单个细胞并铺板到 rLN511E8 包被的培养板上，与其他基质相比，它们可以有效地形成细胞克隆。
有几种用于人类 iPSC 的第二代 Xf 培养基，例如 TeSR2 和 NutriStem。然而，当与 rLN511E8 结合使用时，这些培养基不能保持 iPSC 多能性。另一方面，另一种商业 Xf 培养基 StemFit 可用于获得与在饲养层细胞上培养的 iPSCs 克隆相当的人类 iPSCs 克隆 (表 2)。总体而言，rLN511E8和StemFit的组合作为一个FF-XF系统工作得很好(233)。该系统已被用于将人类原代成纤维细胞、T细胞、其他外周血细胞和脐带血重新编程为具有相似形态、标记基因表达水平和稳定性的iPSCs。
