【测序实验】翻译组测序的简介和实验流程
# 一、翻译调控：
原核生物：基因表达的调控主要在转录水平上进行；
真核生物：由于RNA较为稳定，除了存在转录水平的调控以外，在翻译水平上也进行各种形式的调控。
# 二、控制真核生物的mRNA翻译调控的因素：
1）mRNA降解速率
2）mRNA的长短、结构、GC含量
3）核糖体的数量及翻译速率
如：癌症细胞中，原癌基因的mRNA，翻译速度较慢，保证了肽端的折叠结构正常；抑癌基因的mRNA，翻译速度加快，让肽段折叠异常而失去功能。同时，翻译的速率，受mRNA的寿命，长度，核糖体拷贝数等影响。
# 三、为什么要研究翻译组
1，转录组与蛋白组的相关性
mRNA的转录速度和翻译速度可能是不相同的，mRNA转录后调控是普遍存在的，同时不同蛋白的稳定性是不一样的
2，转录组与翻译组的区别
转录组测序是指，将所有含有ployA尾巴的mRNA进行测序。
翻译组测序是指，将只结合了一串核糖体的mRNA（正在翻译中的mRNA）进行测序。
# 四、翻译组测序的分类
1、核糖体图谱分析（ribosome profiling）——对核糖体内含的mRNA段进行测序分析
通过RNA酶处理细胞裂解物，把不受核糖体保护的RNA降解掉，然后应用密度梯度离心的方法，分离被核糖体保护的mRNA片段。核糖体图谱分析（ribosome profiling）可通过核糖体密度来测定翻译起始位点、或转录本中的翻译暂停，可用于分析mRNA不同区域的密码子组成的影响。
流程图示：
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2、全长核糖体新生肽链复合物 (Ribosome Nascent-chain Complex,RNC)：——对串联在核糖体上的全长mRNA进行测序分析
细胞进行翻译时， 核糖体结合在 mRNA 链上并移动， 依据 mRNA 上的三联密码子信息来逐步合成蛋白质多肽链 ( 称为新生肽链， nascent-chain)。主要常用方法为蔗糖密度梯度离心法，也可以通过核糖体免疫沉淀法（TRAP）。
念珠状多聚体：mRNA在翻译时总是有一串核糖体结合在上面，形成念珠状多聚体
结构图示：
蔗糖密度梯度离心法：
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由于翻译中的mRNA与工作中的一串核糖体紧密结合，根据核糖体的沉降系数，通过蔗糖密度梯度离心,.可以将核糖体和串联在一起的mRNA沉淀分离出来了，然后，再进一步将起mRNA纯化分离出来。直接分离翻译中的mRNA非常不容易，可以通过分离核糖体间接分离翻译中的mRNA。
流程图示：
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核糖体免疫沉淀法：
核糖体大亚基的L10a蛋白加上了GFP，这样便能利用GFP抗体把多聚体免疫分离出来，接着进一步将mRNA分离出来。
流程图示：
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# 五、技术比较
1、核糖体图谱分析的局限性
（1） 实验上的局限性
核糖体图谱分析的主要技术挑战是需要在一个特定的生理学状态下，快速抑制翻译来捕捉核糖体快照。
（2） 需要推断蛋白合成速度
这一方法准确的前提是所有的核糖体都已经完成了翻译，通常细胞中不同mRNA的翻译延伸速率是相似的。
（3） 污染的footprint-sized片段
污染的RNA片段（包括non-codingRNAs或核糖体蛋白复合物）在核糖体的蔗糖梯度中迁移，因此可能会在核糖体图谱分析的文库中存在，并且导致翻译中错的读取。
（4）不明确的mappingreads
在基因组测序或mRNA-seq中，较长的reads可以帮助更好地进行mapping到正确的位置，核糖体图谱分析中产生的约30bp的核苷酸的短序列不容易mapping。
（5） 材料的数量
与mRNA-seq相比，核糖体图谱分析的主要限制是需要相对大量的样品。
2、全长RNC测序分析
推荐通过完整提取RNA，对翻译中的mRNA进行定性定量研究，且推算蛋白质的含量的方法，可以获得更全面的翻译调控信息。且可以与普通转录组一起测序，可计算出，翻译速率：TR= RNC-mRNA(rpkM) / mRNA(rpkM)。
获取完整全长的RNC，将特定时空下的翻译快照保留下来，需要极为严格的实验环境和连贯的操作。
翻译组的样品一般分为三类：
1）动物的培养细胞：在活细胞特定状态时，让细胞主动吸收核糖体固定剂，将核糖体快照保留下来，能非常好地，还原翻译中的mRNA，稳定性最高。
2）动物组织：动物组织容易受组织的类型、极为丰度的内源性RNase酶等，而影响RNC的捕获。如高脂肪、高钙化、块状较大的、带血液的的，会降低RNC的捕获效率。
建议对新鲜组织块在组织核糖体固定剂下，快速冲洗，切割后才进行保存或分离RNC。
3）植物组织：植物组织容易受多糖多酚多纤维、内源性RNAase酶等，而影响RNC的捕获。如含高淀粉和糖的果实类、含多酚的粘液的茎，会降低RNC的捕获效率。
建议对植物的组织类型进行评估，选择幼嫩、新鲜、多糖多酚含量低的组织类型。直接提取或液氮速冻保存。
