Nature Medicine | 个体化、异源的黑猩猩腺病毒和

文献链接：Individualized, heterologous chimpanzee adenovirus and self-amplifying mRNA neoantigen vaccine for advanced metastatic solid tumors: phase 1 trial interim results
发表期刊：Nature Medicine
影响因子：87
发表时间：2022年8月
单细胞转录组测序用于临床I/II期--药效评估与安全性机制研究
该临床试验已经推进到II/III期，招募非小细胞肺癌，结直肠癌，胃食管腺癌，尿路上皮癌：A Study of a Personalized Neoantigen Cancer Vaccine-NCT03639714

0. 研究背景

先前的研究结果表明，一种成功的癌症疫苗应有以下5个特征：(1)靶向肿瘤特异性新抗原，(2)使用高免疫原性疫苗平台(s)，(3)足以刺激机体扩增和启动T细胞反应，(4)与CPI治疗结合，(5)产生长期记忆反应。

在这项最新研究中，研究团队以个性化、异源黑猩猩腺病毒（ChAd68）和委内瑞拉马脑炎病毒samRNA载体为基础的新抗原疫苗作为主要研究端点，评估其安全性和耐受性等指标。

1. 临床前实验

在NHPs中评估了针对猴免疫缺陷病毒（SIV）模型抗原的免疫应答的效力和作用时间，以及皮下注射抗CTLA-4的影响
理解备注：恒河猴的组织相容性复合体命名为MAMU（就如同人类的被称为HLA）；NHP特异性MAMU-A*01限制性SIV抗原插入到ChAd68和samRNA疫苗平台

1.1 疫苗接种诱导NHPs中持久的CD8+ T细胞应答

实验设计：

• （1）疫苗接种方案：对MAMU-A*01阳性的恒河猴（n=11）进行肌肉注射ChAd68疫苗首次激发免疫，接下来的第4、12和20周时通过肌肉注射samRNA疫苗增强免疫，第32周再给予ChAd68增强型疫苗，第106周（n=11）再给予samRNA增强型疫苗（图1）
• （2）CPI治疗方案：以上参与疫苗接种方案的恒河猴中（n=11），其中部分实验动物（n=6）伴随使用伊匹单抗（CTLA-4单抗），部分（n=5）未接受CPI治疗

图1. 研究治疗计划示意图

• ChAd68疫苗诱导了对所有六种抗原的免疫反应：在给予samRNA后，启动的T细胞反应增强，两组患者在启动32周后仍可检测到T细胞反应；同时给予注射伊匹单抗可维持整体较高的T细胞反应（图2b）
• 增强型ChAd68疫苗能显著刺激免疫反应：第32周再给予ChAd68使T细胞反应分别增加12-15倍（图2c）
• 增强型samRNA疫苗能显著刺激免疫反应：第106周再给予samRNA疫苗，在第107周检测到的抗原特异性T细胞反应增加8-17倍（图2d）
  图2. 用ChAd68和samRNA进行异源疫苗接种可诱导NHPs中广泛、持久的CD8+ T细胞反应，这些反应可长期检测到（注射2年后仍然显著提高）；图b. 抗原特异性T细胞反应评估：研究不同组在不同时间点的T细胞反应；图c.ChAd68增强前后（32th周和33th周）抗原特异性T细胞反应：每只动物对所有抗原的平均反应；图d. samRNA增强前后（106th周和107th周）抗原特异性T细胞反应：每只动物对所有抗原的平均反应

2. 临床实验

针对个体化预测的肿瘤疫苗的免疫反应以及疫苗引起的T细胞多样性分析在临床I/II期实验进行
研究对象：转移型MSS晚期结直肠癌；非小细胞肺癌；胃食管腺癌
研究第1期的主要终点是安全性、耐受性和RP2D。
次要和探索性终点包括免疫原性、OS、制造患者特异性疫苗的可行性和ctDNA的变化。
所有患者中（包括疫苗接种前缺乏免疫反应的MSS-CRC患者）均观察到肿瘤新生抗原诱导的特异性CD8+ T细胞。同时，ctDNA减少，疾病稳定，肿瘤体积缩小的特征都表明该手段在CPI难治型患者中存在潜在的临床有效性。

在肿瘤I期临床试验中，主要目的是为了找到 II期推荐剂量（RP2D） 或者 MTD（最大耐受剂量）；总生存（overall survival，OS），定义为：从随机化开始至（因任何原因）死亡的时间。

1. 方案设计：（参考图4a）

入组患者：符合条件的患者共计14位：中位年龄为59岁；肿瘤类型包括转移性MSS-CRC（n=7）、GEA（n=6）或NSCLC（n=1）
疫苗生产：对于每个累计预测新抗原评分达到30的患者，筛选20个排名最高的突变纳入密码子优化的疫苗表达盒中。为15名登记的患者生产了患者特异性疫苗（证实这种个体化疫苗接种方法的生产可行性），后续有1位患者放弃接受研究治疗。
疫苗注射：ChAd68疫苗注射单针后，后续多次静脉注射samRNA疫苗，疫苗剂量分3个梯度（30ug, 100ug, 300ug）
CPI治疗方案：14例患者接受疫苗接种和每月的静脉注射PD-1抗体（尼鲁单抗，每4周480mg），另外，dose level 3和dose level 4的患者也同时接种伊匹单抗（30mg）
其他：4例患者（G1、G8、G9和G10）继续接受了研究治疗的标准护理化疗，8例患者在初次接种疫苗24周后接受了单一的加强型ChAd68疫苗

2. 实验设计：（参考图3）

图3. 概述个性化疫苗生产、计划给药计划和免疫监测的示意图

2.1 个体化疫苗方案安全、耐受性良好

• 个性化疫苗治疗相关副反应低：发热（86%）、疲劳（43%）、肌肉骨骼和注射部位疼痛（均为36%)和腹泻（29%）；严重的TRAEs与已知的CPI治疗的安全性基本一致，包括发热、十二指肠炎、转氨酶增加和甲状腺功能亢进各一个计数（图4b）

图4. 首次在人体中的数据显示，该疫苗方案是安全的，并诱导CD8+ T细胞对预测的患者特异性癌症新抗原反应；图a.临床I期研究的剂量递增示意图；图b. 安全性数据：TRAEs>10%和所有治疗相关的严重不良事件（AEs）：蓝色bar表示1-2级，橙色bar表示3-4级；图c左. 治疗前患者PBMC中的抗原特异性T细胞反应评估：都在基线水平；图c中：ChAd启动和samRNA增强后抗原特异性T细胞的最大反应；图c右. ChAd增强后的最大反应；虚线表示检测限（LOD）和定量上限（ULOQ）

2.2 疫苗诱导新抗原特异性免疫应答长效持久

设计了个体患者最小表位（8-11mer）肽池（包括40个排名最高的预测新表位），标记为 CD8 pool，用于取患者PBMC通过与对应肽池孵育刺激IFN-γ反应，然后体外ELISpot检测IFN-γ反应强度

• ChAd68疫苗显著诱导新抗原特异性CD8+ T细胞：接种疫苗前，只有15%的患者对新生抗原肽池的反应超过LOD值；疫苗接种后均显著提升（图4c）
• ChAd68疫苗诱导的T细胞应答长效持久：在3例现有纵向样本中，第52周仍然检测到抗原特异性T细胞的高效应答（图5 A,B）
• 更低的剂量和更长的间隔可能有助于samRNA平台驱动T细胞反应：患者G1（GEA，伴随化疗）中，T细胞在samRNA增强疫苗注射的8周间隔内扩大了1.5倍，并在第52周给予samRNA疫苗后的16周内持续保持>700 SFU/10^6细胞；G3患者（NSCLC）中，观察到在第24周和第36周时，samRNA剂量之间的CD8+ T细胞反应增加了7倍；患者G2（GEA）T细胞反应在第4周至第13周的（9周）samRNA给药间隔期间显示~1.5倍的T细胞反应增加（图5A,C）

2019年新冠病毒限制期间，samRNA给药间隔延长了8-16周，揭示了samRNA增强T细胞反应动力学的有趣见解

图5. 疫苗诱导新抗原特异性免疫应答长效持久；图A. 所有可用样本（除G5外）在不同阶段取样，体外特异性肽池过夜刺激后的IFNγ ELISpot数据；图B. G1,G2,G8在不同阶段取样，体外特异性肽池过夜刺激后的IFNγ ELISpot数据；图C. 疫苗注射前后ELISpot反应差异：折线图显示了接受30µg samRNA（浅蓝色）、100µg samRNA（中蓝色）和300µg samRNA（海军蓝）的患者的配对数据

2.3 CD8+ T细胞可以识别多个HLA等位基因中的新抗原

因为 CD8 pool 这种探索最小表位池设计不包括每种突变对应的所有潜在新抗原（即，太短了），并且不成比例地支持较高预测分数的突变抗原形式，因而作者额外设计了称为 15 mer pool的表位池

• 较长的抗原肽诱导抗原特异性T细胞免疫反应需要混合CD4 T细胞参与：在5例有可用样本（G1、G2、G8、G8、G11和G14）的患者中，分析了对同源CD8 pool和15mer pool的CD8和CD4 T细胞偏倚的反应。根据肽长度的预期，CD8 pool刺激后的IFN-γ反应是由CD8 T细胞驱动的，而对15mer pool刺激的反应是CD8驱动或混合CD4/CD8 T细胞反应（图6）

图6.流式图显示CD4或CD8缺失（del）PBMC群体中CD8和CD4 T细胞的相对频率。相应的ELISpot数据（技术重复±s.d.的平均SFU）用二甲基亚砜（DMSO）、total PBMCs（黑色bar+灰色圈）、CD4缺失PBMC（蓝色bar+黑方块）、CD8缺失PBMCs（橙色bar+红三角）分别与CD8 pool与15 mer pool 孵育

• 个性化疫苗能够激活多种抗原特异性T细胞：所有12例患者在治疗后的时间点均可检测到T细胞对多个突变的反应（图7a）
• CD8+ T细胞可以识别多个HLA等位基因中的新抗原：G1,G2,G8患者的混合白细胞pool对3位患者个性化疫苗中>50%的多个HLA等位基因中的新抗原产生阳性反应（图7b,c）

Peptide-HLA (pHLA)四聚体被生成，用于评估抗原特异性T细胞的广度和记忆表型。基于G1,G2,G8的HLA设计pHLA与对应的T细胞孵育

• 个性化疫苗诱导的特异性T细胞具有较强的记忆特性：与总CD8 T细胞相比，四聚体阳性CD8 T细胞的效应记忆特征高1.3-1.5倍，幼稚T细胞的频率低20倍（图7d）
• ChAd68 boost疫苗显著提高患者抗原特异性效应记忆细胞比例：患者G1的ChAd68 boost导致四聚体阳性细胞增加10倍，增强后四聚体阳性CD8 T细胞由≥93%的效应记忆细胞组成（图7e）。

图7. 疫苗诱导多种新抗原的多克隆效应记忆CD8 T细胞应答；图a. 患者PBMC体外和post-IVS在抗原特异性minipool刺激：横坐标表示不同患者，纵坐标表示反应比例，不同的颜色表示不同的minpool；图b. 最小阳性表位检出量：检出多肽阳性的数量：无法检出阳性反应的用'x'表示； 图7. 疫苗诱导多种新抗原的多克隆效应记忆CD8 T细胞应答；图c. 预测的患者特异性HLA I型递呈抗原阳性（panel b）；图d. G2患者中pHLA（A*30：04、A*02：01、B*08：01）的识别和相应的T细胞记忆表型； 图7. 疫苗诱导多种新抗原的多克隆效应记忆CD8 T细胞应答；图e. G2患者在ChAd68增强前后对pHLA（B*44：05）的识别情况和相应的T细胞记忆表型

2.4 疫苗诱导CD8+ T细胞是多功能的，可以杀死靶细胞

评估该疫苗方案可以诱导细胞毒性T细胞，杀死在MHCI类环境中呈现同源表位的靶细胞
细胞内细胞因子染色 (ICS) 是一种非常有用且广泛使用的基于流式细胞术的检测方法，可检测细胞刺激后内质网内细胞因子的产生和积累。染色原理： 使用特定肽或非特异性激活混合物激活细胞---->添加蛋白质转运抑制剂（例如布雷非菌素 A）以将细胞因子保留在细胞内---->洗涤后，可以将针对其他细胞标志物的抗体添加到细胞悬液中---->然后将细胞固定在多聚甲醛中并透化---->加入抗细胞因子抗体---->细胞可通过流式细胞仪分析

• 抗原特异性CD8+ T细胞是多功能的：通过IVS体外培养将G2和G8的PBMCs与CD8 pool孵育扩增，检测到IFN-γ+，CD107α+，肿瘤坏死因子α（TNF-α）+和白细胞介素-2（IL-2）+CD8T细胞，增加2~700倍（图8a）；布尔门控证实了两名患者均存在四、三、双阳性多功能CD8 T细胞（图8b）
• 抗原特异性CD8 T细胞能够杀死呈递新抗原的靶细胞：将G2患者的抗原特异性T细胞与同型抗原肽表达的靶细胞共孵育，能够显著降低靶细胞活性（图8c）
  图8. 肿瘤新抗原反应性CD8 T细胞具有功能多样性，能够杀死HLA呈现目标同源肽的肿瘤细胞；图a. G2患者经DMSO或患者特异性CD8 pool刺激后产生IFN-γ、CD107α、TNF-α和IL-2流式分析图；图b. 通过CD8+细胞因子+群体的布尔门控评估多功能性：饼状图显示了体外pbmc和IVS后pbmc的多功能性，饼弧用红色（CD107α）、石灰绿色（IFN-γ）、绿松石色（TNF-α）和海军蓝（IL-2）表示单个细胞因子，饼类部分描述了表达多种细胞因子的细胞的频率（详细参考下方图例，不同颜色表示不同阳性类别），主要功能划分为红色（CD107α、IFN-γ、TNF-α和IL-2呈四倍阳性）、橙色（CD107α、IFN-γ和TNF-α呈三倍阳性）和黄色（CD107α和IFN-γ呈双阳性）

2.5 疫苗诱导的T细胞实现肿瘤浸润

实验分组：患者治疗前和治疗后
样本类型：肿瘤穿刺组织和PBMC
实验类型： 肿瘤穿刺组织（基因组测序）；PBMC样本（scRNA-seq & TCR-seq）

图9. 实验设计概览

单细胞测序结论：

• 与基线水平相比，治疗后样本中的新抗原反应性CD8+ T细胞增加了1.6倍至6.4倍（图10 b）

• 对转录激活特征的分析证实了CD8+ T细胞在处理后的样本中显著富集（图10 c）

• TCR分析显示，在G1和G3患者接种疫苗后，PBMCs中分别检测到12种和30种不同的 TCR克隆型（de novo + expanded）（图10 b）。

• 通过对T细胞各克隆型中IFNG、GZMB、TNFA和IL2转录本的分析显示，与基线水平相比，两名患者在治疗后的样本中表达两种或两种以上细胞因子转录本的频率增加了12-98倍（图10 d，e）

  
  图10. 单细胞测序结论；图B. Post-IVS ELISpot分析：基线(W0、橙色），治疗(W16；蓝色）时间点对应于G1和G3患者治疗时的肿瘤活检样本（W16），TCR克隆型分析来源于PBMC scRNA-seq；图C. 小提琴图显示了G1和G3患者的基线（橙色）和治疗时（蓝色）PBMC样本中CD3、CD4和CD8 mRNA表达的分析；图D. UMAP图显示了处理样本中表达TCR克隆型的单个细胞（封闭的圆圈，G1=12，G3=27），并表达0、1、2、3或4个细胞因子转录本；图E. UMAP图显示个体细胞表达≤1（蓝色）和≥2细胞因子（红色）和感兴趣的TCR克隆型（G1为=12，G3为=27），比较基线和处理样本

来自G1和G3患者的基线和治疗时的肿瘤活检样本通过批量DNA测序分析TCR-β CDR3序列的存在。通过PBMCs中的单细胞RNA测序独立获得的TCR-β CDR3序列与肿瘤样本中的DNA测序的分析表明，血液和肿瘤中假定的新抗原特异性T细胞存在重叠。

• 对于患者G1，在基线和治疗时的肿瘤样本中发现了341个TCR-β CDR3克隆型，其中治疗期显著富集了9个克隆，其中的2种也在治疗时活检时取样的PBMCs中被发现（图11d）
• 在患者G3中，通过基线和治疗时的肿瘤样本DNA测序共鉴定出294个TCR-β CDR3克隆型，其中40个克隆型在治疗时的样本中显著富集。在治疗时活检中富集的40个TCR-β CDR3克隆型中的5个与在治疗时活检时在PBMCs中激活的TCR克隆型重叠（图11d）

结论：肿瘤组织中新抗原特异性CD8 T细胞的克隆型，提供了疫苗诱导的周围新抗原特异性T细胞能够浸润肿瘤的概念证明

图11. 疫苗诱导的T细胞实现肿瘤浸润；图c. IVS扩增G2患者的PBMCs杀死靶细胞（B*08：01，B*57：01，A*30：04）：图显示了基于NucRed计数的相对可行性，并随时间归一化为效应靶比10：1 DMSO控制。数据以平均± s.d表示。对于单独用DMSO（灰色圆圈）或同源肽（黑色方块）刺激的重复孔，以及用DMSO（浅蓝色圆圈）或同源肽（海军蓝色方块）刺激的10：1效应/目标共培养；图d. G1和G3患者TCR β链测序：TCR-β链在PBMCs中扩张，在PBMCs和肿瘤中扩张，并收缩

2.6 MSS-CRC患者存活时间延长，ctDNA含量降低

评估指标：OS和通过成像评估的肿瘤大小的变化（RECIST v1.1，次要终点），转录谱和ctDNA的变化（探索终点）。
根据RECIST v1.1（实体瘤疗效评估标准），客观缓解率和无进展生存期显示一个GEA患者有完全缓解，以及多个肿瘤类型的患者病情稳定（SD）。考虑到在几例MSS-CRC患者中观察到的SD，作者重点分析了这7例MSS-CRC患者的OS次要终点和ctDNA较基线变化的探索性终点。对于MSS-CRC患者，7例患者中有3例（42.9%）仍然存活，12个月的OS率为42.9%，反映了多个患者经历了持久的获益。新的证据表明，治疗时ctDNA水平相对于基线的变化是一个有用的生物标志物，可以将患者分为有分子应答者或无分子应答者，并区分预后良好的患者，特别是那些根据RECIST v1.1标准有SD的患者。

• 本研究队列皆为CPI难治性的冷肿瘤： 在患者治疗前的肿瘤活检样本中，分析了对CPIs敏感性肿瘤的标准基因组相关性（即肿瘤突变负担、CD274（PD-L1）和IFNG RNA测序特征），并与癌症基因组图谱（TCGA）中的相关癌症类型进行了比较。预处理患者基因组数据显示，本研究中MSS-CRC和GEA患者的肿瘤突变负荷较低，PD-L1表达较低，且这些肿瘤的免疫反应性较低（图12 a,b）。这种冷性肿瘤已知对CPI治疗是难治性的。

• 长期接受疫苗治疗患者ctDNA明显降低： 在这些患者中，100%（3/3）治疗时间<6个月的ctDNA浓度增加，而疗程≥6个月的75%（3/4）患者表现出分子反应（<较基线水平50%；图12c）。2例患者在治疗期间ctDNA完全清除（G8和G14；图12c）。最值得注意的是，这些ctDNA的这些下降在OS延长的患者中更为常见（中位OS未达到，而不是7.8个月；图12d）。
  

  图12. 在晚期癌症患者群中，MSS-CRC患者出现临床疗效的早期信号；图a. 治疗前患者的肿瘤样本RNA-seq数据散点图：横轴表示对应癌种在TCGA的相对肿瘤突变负荷，纵坐标表示PD-L1归一化的表达量；图b. IFN-γ信号强度比较：TCGA样本- MSS-CRC（n= 286）、MSI-CRC（n= 62）、胃（n= 406）、肺腺癌（肺Ad.）_（n= 498），肺鳞状（肺平方平方）（n= 463）和黑色素瘤（n= 436），临床研究患者-MSS-CRC（n= 7），GEA（n= 6）和NSCLC（n= 1）；图c. 研究治疗开始后ctDNA相对于基线水平的变化百分比，显示为最佳反应，并由基于RECIST的反应和治疗时间着色。蓝色的患者均接受研究治疗>24周，其中2例患者的治疗超过了基于RECIST的进展性疾病（PD），在24周后未得到证实，并继续接受研究治疗；图d.自ChAd68启动以来，ctDNA减少（=4）或没有减少（=3）的MSS-CRC患者的生存概率。数据截止日期：2022年1月31日；

病人G8,51岁的MSS-CRC患者接受化疗21个月，进入研究队列前的一线化疗存在肿瘤进展，后期接受肿瘤新生抗原疫苗时继续伴随标准的化疗方案，通过影像学评估肿瘤缩小和ctDNA降低。16周内多个肺病变部位缩小，48周内多个肺和一个肝脏病变部位持续缩小（图12e）。PET扫描成像显示稳定性肝病变组织中高代谢细胞降低（提示该疫苗方案的抗肿瘤活性没有被计算机断层扫描成像所证明）

PET（正电子发射断层摄影）是新发展起来的核医学检查方法。扫描前先给病人注射一种标记某种正电子的放射性制剂，从它们所参与的代谢过程来测定脑组织的代谢改变。是目前惟一可在活体上显示生物分子代谢、受体及神经介质活动的新型影像技术，现已广泛用于多种疾病的诊断与鉴别诊断、病情判断、疗效评价、脏器功能研究和新药开发等方面。

图12. 在晚期癌症患者群中，MSS-CRC患者出现临床疗效的早期信号；图e. 影像学图片展示G8患者肺部和肝脏肿瘤在治疗前后的病变：箭头表示相关靶向病变

3. 展望

疫苗驱动的T细胞应答是(1)跨多重突变和HLA等位基因的多克隆，(2)具有多功能性，(3)能够杀死呈现同源肽的靶细胞。值得注意的是，在接受低剂量samRNA的患者中观察到T细胞反应更一致的增加。