怎么样才算是完整的单细胞分析？为什么别人能轻轻松松6分+？
Single‐cell transcriptomics reveal the intratumoral landscape of infiltrated T‐cell subpopulations in oral squamous cell carcinoma
单细胞转录组学揭示了口腔鳞状细胞癌中浸润T细胞亚群的腔内景观
发表期刊：Mol Oncol
发表日期：2021 Jan 29
影响因子：6.574
DOI: 10.1002/1878-0261.12910
一、研究背景
大量证据表明，肿瘤微环境（TME）的免疫浸润和TME内恶性和非恶性细胞之间的异质性和相互作用对肿瘤生物学的不同方面至关重要。随着微流控技术的进步，单细胞RNA测序（scRNA-seq）的使用使得从活检样本中的数千个细胞能够在单细胞水平上同时进行分析。
头颈癌是全球第六大恶性肿瘤。口腔癌的发病率约占头颈癌的28%，口腔鳞状细胞癌(OSCC)占口腔癌的90%以上，全世界每年新发病例超过35万，死亡病例超过17万。OSCC的组织学等级可从分化良好的角化癌到未分化的非角化癌不等，且有较高的转移倾向。
二、材料与方法
1 数据来源
1）本研究包括1名女性和2名男性患者，病理诊断为OSCC。从患者身上获取新鲜的OSCC肿瘤和成对的相邻正常组织，用于后续的淋巴细胞分离。相邻正常组织距离肿瘤组织至少2cm。
2）使用的OSCC细胞系（HSC-3和CAL-33；均来自男性患者）
3）数据可用性声明：scRNA-seq原始数据已存入NCBI序列读取档案（SRA）数据库（PRJNA650256）
4）30例OSCC患者的匹配肿瘤和正常组织，对其进行免疫组化染色
2 分析流程
1）单细胞采集和cDNA扩增：使用铬单细胞控制器（10x Genomics）进行单细胞捕获
2）文库构建与测序
3）数据质量和过滤：使用Cellranger工具包（v3.0.2）获得原始计数矩阵并进行过滤
4）簇和伪时间分析：使用R包'Seurat'对单细胞计数矩阵进行聚类分析；根据簇标记和簇标签从R包'SingleR'分配簇细胞类型；使用'DoHeatmap'函数表征簇，同时使用R包'monocle 2'进行伪时间分析
5）基因本体富集分析：使用R包'clusterProfiler'确定簇的基因本体(GO)特征
6）人类T细胞的分离和活化（使用人外周血单核细胞）
7）细胞培养和凋亡试验、羧基荧光素琥珀酰亚胺胺酯（CFSE）标记、双荧光素酶报告试验
三、结果展示
01 - 肿瘤特征及单T细胞转录组数据生成
对从3例OSCC患者的肿瘤和邻近正常组织中分离出来的FACS分选T细胞进行了scRNA-seq（图1A）。在使用CD3、CD4和CD8的免疫组化染色（IHC）确认浸润性淋巴细胞的存在后（图1B），从肿瘤和相邻正常组织的单细胞悬液中分选Calcein+ CD3+活体浸润性T细胞（图S1），并获得共11866个细胞的单细胞转录组数据（图1C）。肿瘤组织中CD8+T细胞的比例远高于配对的相邻正常组织（图1C,D），表明由于肿瘤抗原的刺激，TME中CD8+细胞毒性T细胞可能富集。CD4:CD8比值降低，表明抗原刺激的抗肿瘤免疫反应更加强大。
图1 用于单细胞RNA测序(scRNA-seq)的口腔鳞状细胞癌(OSCC)样本的总体特征
图S1 使用荧光激活细胞分选法分离活的肿瘤浸润淋巴细胞
02 - TME的T细胞聚类和亚型分析
根据基因表达谱，作者在肿瘤中发现了14个不同的细胞簇，包括9个CD8+T细胞簇，4个CD4+T细胞簇，1个γδT细胞簇，每个细胞簇都有独特的标志功能（图2A和S2A）。根据其标志基因的表达来识别这些簇（图S2B和S2C）。
图S2 T细胞亚群的特征图和基因热图
在不同的CD8+簇中，簇0包括组织驻留的记忆T细胞(TRM)，因为ZNF683的高表达。图2B,C）。这个TRM样簇表现出来自效应标志物基因的高表达，该簇也显示出免疫检查点的高基因表达（图2B,C）。
簇1通过NKG7、GZMB、GZMH和GZMA的基因表达，将TEM特征描述为效应器记忆T细胞（TEM）。簇3显示了检查点标志物的高表达基因，这些标志物在耗竭的T细胞中也是高表达的（图2C）。因此，簇3被定义为耗竭的T细胞（TEX）簇，表明这可能在OSCC的T细胞耗竭中发挥重要作用。簇4显示出高表达的细胞周期相关基因的标志物（图2B,C），可能是由于对癌症新表位的免疫反应。根据CellCycleScoring，将簇4定义为有丝分裂的TEM簇。虽然该簇表现出高IFNG表达，但它也和簇2一样表达了高水平的检查点分子（图2B,D）。由于NKG7、PRF1、GZMB、GZMH、GZMA和IFNG等标记基因的高表达，6、8、9、11和12五个簇被定性为TEM簇。此外，簇8和簇12显示出晚期分化效应器和效应器记忆标记基因KLRG1的特异性表达（图2B,C）。因相关标志物TRDC、XCL1和XCL2的基因表达，将簇13指定为γδT细胞簇。
还确定了四个主要的CD4+T细胞簇（图S2C）。簇2由大多数CD4+T细胞组成，由于明确的Treg标记物FOXP3的特异性mRNA表达，被确定为调节性T细胞(Treg)群（图2D）。该簇表现出共刺激分子基因的高表达，此外还有其他定义明确的Treg标志物。与簇2相比，被定义为有丝分裂的Treg簇的簇10表现出类似的基因表达谱。簇5表达了高水平的 "naïve "标记，从而代表一组分化程度较低的效应记忆T细胞。簇 7表达了高水平的PDCD1和CTLA4 mRNA，这提示了耗竭的CD4+T细胞。
图2 在OSCC生态系统中CD8+和CD4+T细胞的表达异质性
03 - 伪时间分析揭示了OSCC浸润淋巴细胞的动态状态转换情况
作者应用Monocle 2算法来构建CD8+和CD4+簇的潜在发育轨迹。
关于CD8+簇的轨迹（图3A），分支的缺乏反映了不同前体的缺乏以及浸润TME的CD8+T细胞的终末分化性质。簇8_CD8+ TEM和3_CD8+ TEX位于相邻位置，表明在OSCC中，这两个特斯拉细胞亚群是高度异质的，它们不应该被看作是一个同质的群体。0_CD8+ TRM、4_CD8+有丝分裂TEM和9_CD8+ TEM三个增殖簇位于伪时间路径分支的两端，说明它们与其他簇相比基因表达谱不同。
利用CCR7、LEF1、PDCD1、HAVCR2、LAG3等著名的簇标记来证明相关基因在伪时的动态变化（图3B）。发现在T细胞分化过程中，naïve相关标志物的mRNA表达水平急剧下降，而耗竭标志物和效应分子的mRNA表达水平逐渐上升，但在有丝分裂后期有所下降，有丝分裂基因的表达在有丝分裂期达到高峰。
同样，分析了CD4+T细胞，包括四个分支（图3C）。集群5_CD4+TEM，它表达高水平的naïve标记mRNA，位于起点。伪时间轨迹演化成两个方向，一个向簇7_CD4+TEM，另一个向簇2_CD4+Treg。随着CD4+T淋巴细胞的分化，T细胞从幼稚状态过渡到分支点4，然后再过渡到调节状态或耗竭状态，代表了CD4+T细胞从幼稚T细胞分化到Treg或TEX的过程。在这个过程中，naïve标志物mRNA的表达逐渐减少，而Treg标志物mRNA的表达急剧增加（图3D）。此外，还发现了分支点4的分支依赖性基因（图3E）。从状态3过渡到状态6的细胞，Treg相关蛋白的mRNA表达量很高，而当细胞过渡到状态5时，效应分子和趋化因子的mRNA表达量增加。
图3 基因表达动态沿T细胞发育的伪时间进行
04 - OSCC患者T细胞簇的功能异质性及预后价值
为了进一步了解OSCC浸润淋巴细胞的功能异质性，通过GO分析评估了CD8+和CD4+集群的差异表达标记基因（图4A）。虽然离体再活化实验已经证明CD8+耗竭的T细胞产生较少的效应细胞因子，但本分析显示，簇3_TEX也富集了与T细胞活化和功能相关的途径，表明TEX细胞可能还没有完全丧失体内的抗肿瘤效应潜能。
为了进一步了解该簇的表型，分析了TCGA中独立的HNSCC队列。簇3具有预后价值（图4B），与这些基因高表达的患者相比，簇3标志性基因低表达的患者总生存期明显更好（图4C）。集群0_CD8+ TRM突出地富集了免疫相关的途径（图S4A），表明组织驻留记忆T细胞在实体瘤的控制中具有特殊的作用。
关于CD4+T细胞，富集包括 "JAK-STAT信号通路"、"Th17细胞分化"、"NOD样受体信号通路"、"Th1和Th2分化 "和 "TNF信号通路"（图4D）。簇2_CD4+ Treg细胞几乎富集在所有相关途径中，表明Tregs是一个功能活跃的效应细胞亚群（图4D和S4B）。为了了解簇2在TME中的复杂作用，利用TCGA的队列中现有的基因表达数据，发现簇2具有预后价值（图4E），Treg的低表达与更好的总生存率显著相关（图4F）。簇10_Mitotic Treg富集于 "细胞周期途径"，而簇7_CD4+ TEM富集于 "PD-L1表达和PD-1检查点途径在癌症中的应用"，表明T细胞衰竭的表型。集群5_CD4+ TEM除'T细胞激活'信号传导外，其他与T细胞效应器功能相关的通路富集度最低。
图4 OSCC患者各簇T细胞免疫信号的预后价值
图S4 肿瘤组织簇0和2的免疫途径相关的基因本体(GO)生物过程柱状图
05 - 正常组织浸润的T细胞比较均匀
在正常组织浸润的T细胞中只发现了3个CD8+簇（1、2和3），2个CD4+簇（0和4），以及一小簇自然杀伤（NK）T细胞（FGFBP2+，簇6）（图5A和S5）。由于TRM标志物ZNF683的特异性表达，簇3被定性为由组织驻留记忆T（TRM）细胞组成。除了种群下降（图S6A），簇3表达的效应分子远少于肿瘤中的TRM。簇1是正常组织中CD8+T细胞的主要效应子集，因为效应分子和趋化因子基因的高表达水平（图5B），以及T细胞活化和功能途径的富集（图S6B）。
图S5 与图5A相关的正常组织T细胞群中关键基因的特征图
此外，与原发肿瘤中的CD8+增殖亚群和衰竭亚群相比，正常组织中没有CD8+增殖亚群和衰竭亚群（图5C和S5），说明正常组织中的CD8+T细胞处于相当静止的状态。关于CD4+T细胞，根据它们的标记基因确定了两个集群的特征（图5D），T细胞的一个小的子集，簇4，由于FOXP3的特异性表达而被定性为Tregs。Tregs在TME中的过度积累（图S6）可能有助于免疫抑制性微环境。与CD8+ TRM相似，Tregs比它们的肿瘤对应物更静止，因为它们表达低水平的共刺激分子和较低的T细胞活化途径富集（图5D）。通过TEM鉴定了簇0，并利用GO分析发现富集了TNF和NF-kappa B信号通路（图S6D）。
图5 正常组织中CD8+和CD4+T细胞的异质性
图S6 对正常组织进行补充分析
06 - PD1和PDL1在OSCC中上调
正常和恶性口腔鳞状上皮的IHC结果如图6所示。PD1的表达在OSCC浸润的淋巴细胞中上调(图6A)，但在正常组织中浸润的淋巴细胞中没有上调(图6B)，而PDL1的表达在OSCC肿瘤细胞中上调(图6C)，但在正常细胞中没有上调(图6D)。这些结果表明，在OSCC中普遍存在PD1+耗竭的T细胞。
图6 使用PD-1和PD-L1抗体进行免疫组化染色的结果（n = 30）
07 - T细胞表型提示调节剂调控OSCC抗肿瘤免疫反应
耗尽的T细胞广泛存在于OSCC微环境中，为了确定参与调控瘤内T细胞耗尽的关键反式活性调节因子，作者重点研究了差异表达基因（DEGs）中的转录因子，如图2C所示。在作者的数据集中，与胸腺细胞选择相关的TOX表达呈强正相关的10个基因中，有4个基因与T细胞耗竭相关（图S7A），表明TOX是OSCC中T细胞耗竭的关键调控因子。
在TCGA HCSN患者队列中，观察到上述基因的表达与TOX的表达之间存在显著的正相关关系（图7A和S7B）。然而，KLF2和LEF1等naïve相关基因与TOX的表达呈负相关。如图7B所示， TOX的过度表达导致编码幼稚蛋白的基因表达减少，而编码抑制性受体的基因和转录因子的表达增加。
图7 和胸腺细胞选择相关的TOX对人T细胞抗肿瘤功能影响的体外实验
图S7 与TOX表达相关的基因以及TOX对细胞凋亡的影响
由于TOX的表达与CD8+T细胞的耗竭密切相关，作者探讨了TOX在体外对人T细胞抗肿瘤功能的影响。进行3次细胞凋亡实验。如图7C和S7C所示，经过12 h的共培养，PD1 OE组和TOX OE组肿瘤细胞的凋亡率明显低于Ctrl OE组和TOX OE加抗PD1组。TOX过度表达对CD8+T细胞的影响可以被aPD1逆转，说明PD1/PDL1轴在TOX过度表达导致的细胞毒活性降低中发挥了重要作用。
还在CD3/CD28刺激下，在T细胞培养基中培养了三种类型的人CD8+T细胞（Ctrl OE CD8+T细胞、PD1 OE CD8+T细胞和TOX OE CD8+T细胞）。用CFSE标记T细胞，在第2天收集，并使用流式细胞仪测量其增殖。如图7D所示，PD1 OE CD8+T细胞和TOX OE CD8+T细胞与Ctrl OE CD8+T细胞相比，增殖率分别降低了20.4%和18.2%。
08 - 转录因子网络分析显示PRDM1是TOX的关键调控因子
由于TOX被证明在T细胞功能障碍中具有关键作用，使用单细胞调节网络推理和聚类（SCENIC）来研究驱动TOX表达的潜在分子机制。对于总的CD8+T细胞，PRDM1调节子是SCENIC预测驱动TOX表达的前三个调节子之一（图8A）。CD8+T细胞簇上调了驱动TOX表达的不同转录因子网络的表达，PRDM1调节子在簇3中表现出高度的特异性，它们表达高水平的与功能障碍相关的基因（图8B）。利用JASPAR数据库揭示了TOX启动子中转录因子PRDM1的规范结合基团（图8C）。用PRDM1过表达质粒和含有TOX启动子的pGL3报告质粒电转染人淋巴细胞系Jurkat细胞，结果表明，PRDM1激活了TOX基因的转录（图8D）。上述研究结果表明，PRDM1是T细胞浸润OSCC中TOX表达的关键调控因子。
图8 PRDM1激活TOX基因转录
四、结论
在这项研究中，作者对3例OSCC患者从肿瘤中分离出来的11 866个单体T细胞和配对的相邻正常组织进行了scRNA-seq。在肿瘤中发现了14个独特的T细胞亚群，在正常组织中发现了5个亚群，说明TME的T细胞群体与正常组织的T细胞群体相比更具有异质性。对OSCC中浸润性T细胞的scRNA-seq数据构成了宝贵的资源，丰富了对这些细胞在OSCC中功能的理解，并有可能带来有效的免疫治疗策略。
