分子克隆知识

• Kozak consensus sequence (Kozak consensus or Kozak sequence) ：is a nucleic acid motif that functions as the protein translation initiation site in most eukaryotic mRNA transcripts。是一种核酸基序，在大多数真核 mRNA 转录物中充当蛋白质翻译起始位点
• Nuclear localization sequence:核定位信号或序列 (NLS) ： is an amino acid sequence that 'tags' a protein for import into the cell nucleus by nuclear transport.[1] Typically, this signal consists of one or more short sequences of positively charged lysines or arginines exposed on the protein surface. **是一种氨基酸序列，它“标记”蛋白质以通过核转运进入细胞核。 通常，该信号由暴露在蛋白质表面的一个或多个带正电荷的赖氨酸或精氨酸的短序列组成。不同的核定位蛋白可能共享相同的 NLS。 作用原理：NLS序列的靶蛋白首先与细胞浆中的核转运蛋白（importin）形成一个靶向核孔的复合物，然后再与核孔上的NPC结合并进入核内，importin 是由αβ形成的异源二聚体蛋白,其中的α的60ku也称为NLS受体，因为它能够与蛋白NLS直接结合。通常情况下NLS靶蛋白：importinα:importinβ=1:1:1牢固复合体

NLS 具有与核输出信号 nuclear export signal (NES) 相反的功能，后者针对细胞核外的蛋白质。**

• Repressor of primer (Rop引物抑制)： is a small dimeric protein that participates in the mechanism that controls the copy number of plasmid of the ColE1 family by increasing the affinity between two complementary RNAs. 是一种小型二聚体蛋白，通过增加两个互补rna之间的亲和力，参与控制ColE1家族质粒拷贝数的机制。

PCR

Tm值与退火温度：

• Tm值=4（C+G）+ 2(A+T)
• 退火温度=Tm值-（5-10℃）

PCR产物的纯化：（引自德泰生物）

PCR产物纯化的方法 在PCR扩增完成后，反应体系中除了DNA片段，还存在离子、dNTP、引物及聚合酶等物质，这些物质会对后续的实验（克隆、测序等）产生不利的影响，需要对产物进行纯化回收。 回收DNA片段有两种途径，即直接回收和从凝胶中回收，每种纯化途径都有相对应的试剂盒。

质粒的超螺旋结构

产物直接纯化：

在 PCR 扩增完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测，在条带单一无其他杂带的情况下，可以用产物纯化试剂盒对 PCR 扩增产物直接进行纯化。目前市面上的产物纯化试剂盒大多是利用吸附柱的方法，其实验过程为“吸附-洗杂-洗脱”：将 PCR 产物置于 DNA 纯化柱中，产物中 DNA 片段会吸附于 DNA纯化柱上，利用 wash buffer 通过一系列快速漂洗-离心的步骤，将引物、核苷酸、蛋白、酶等杂质去除（洗杂需重复多次以尽可能的洗去杂质，提高产物纯度），最后用洗脱液将 DNA 片段洗脱。

凝胶回收纯化：

如果电泳检测结果存在非特异性条带，则需要通过切胶将目的条带分离出来，随后利用胶回收试剂盒对凝胶回收纯化。凝胶回收纯化与产物直接纯化相比多了一个溶胶的过程，两者纯化原理基本相同。 产物直接纯化与凝胶回收纯化区别产物直接纯化的回收率比胶回收高，但只适用于电泳结果为单一条带的情况。凝胶回收纯化需要先跑胶然后将目的条带切胶回收，纯化产物更纯净。

• 纯化前后都需要进行电泳检测，纯化前电泳目的是验证是否存在目的基因及是否存在非特异性结果，纯化后电泳目的是为了验证是否纯化得到目的基因及计算产物的回收率；
• 不同纯化试剂盒适用的 DNA 片段长度会有所不同，购买前建议先仔细阅读说明书。用不适合的试剂盒会影
  响最终的回收率，甚至无法纯化得到目的 DNA；
• 切胶需在长波长的 UV 灯（紫外灯）下操作，并且快速操作，避免损伤 DNA；
• 如果 PCR 的扩增模板为质粒，需要用切胶回收的方式进行纯化；
• 试剂盒中结合液含有刺激性化合物，操作时要带乳胶手套，避免沾染皮肤、衣服和眼睛；

如何提高回收率？

PCR 产物纯化回收有两个重要的技术指标：纯度和回收率。回收率不理想会使工作量大大的增加，

下面就介绍一些能够提高产物回收率的小技巧：

• 洗脱液提前在水浴锅中 50-60℃预热，同时多次洗脱液可以提高回收率；
• 一些 PCR 产物中可能存在石蜡油，石蜡油会导致回收率降低，因此建议清除石蜡油；
• 使用新配的 TAE Buffer 作为电泳缓冲液，TBE Buffer 或反复使用的 TAE Buffer 都将影响 DNA 的回收率；
• 在电泳时上样孔尽量加满，这样可以在后续切胶过程减少回收胶的重量；
• 切下带有目的条带的胶块体积越小越好；
• 切胶后利用胶回收试剂盒回收，凝胶溶解要充分，溶完胶后稍凉一下再上柱，高温条件下 DNA 不易与柱结合

质粒的线性化（Plasmid linearization）

如果质粒DNA打算用作PCR模板，建议将其用作线性DNA。圆形质粒大多具有超螺旋结构，其目的序列不易被引物和聚合酶获得。（If the plasmid DNA is intended for use as a PCR template, it is recommended to use it as a linear DNA. A circular plasmid mostly has a supercoiled conformation, where the target sequence is less accessible for primers and for polymerase.）

引物

• 引物配置（1OD=1nmol）
  粉剂配置前可4000rmp/1min 离心；粉剂有效期2年；液体有效期6个月；为避免反复冻融可进行分装。推荐使用TE缓冲液(生工生物TE货号（B541019）)进行配置，终浓度为100uM(推荐使用1uM-10mM)
• GC含量：寡核苷酸链中鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）核苷酸的摩尔拌粉笔。例如10mer的引物链含有3个GC，因此GC含量为30%。
• Tm值（溶解温度）:溶解温度是指体系中50%的引物与其模版互补配对时的温度。
• 分子量：是指1mol寡核苷酸链的质量，计算方式为组成寡核苷酸链中所有原子质量的累加，算法为，ATCG加上修饰基团。

普通taq聚合酶：
只有5’-3’端聚合酶活性和5’-3’端外切酶活性。

高保真taq聚合酶：
还有3’-5’端外切酶活性，可以进行矫正。

• DNA电泳：

因为TAE缓冲液的pH约为8.0，而DNA分子在pH为8.0时，磷酸基团全部解离，而碱基几乎不解离，从而使DNA分子带上负电荷，在电场的作用下会向正极移动 总结2：胶染料（Gelstain）和上样缓冲液（10x loading buffer）

1、胶染料作用：对核酸进行染色，使核酸分子在紫外光照射下能够被检测到。

2、上样缓冲液：
①溴酚蓝：可以指示电泳进度，当溴酚蓝染料移动到距离凝胶前沿1~2cm处停止电泳；②甘油、蔗糖：增加样品密度，使样品沉入胶孔。

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质粒图谱信息：

BGH即是较弱的加尾信号

poly(A) tail：真核生物mRNA的3’端都有一段） ，这种尾巴不由基因编码，而是在转录后加到mRNA上的。加尾过程受位于终止密码3’端的加尾信号序列所控制。 在结构基因的最后一个外显子中有一个保守的AATAAA序列，此位点下游有一段GT丰富区或T丰富区，这两部分序列共同构成poly(A)加尾信号。
哺乳动物细胞表达质粒主要是用于转录出mRNA， 常用的转录终止子有SV40, hGH, BGH, 和rbGlob，同时包含有AAUAAA基序促进聚腺苷酸化和转录终止。除了上面列出的，SV40 late polyA 和rbGlob polyA被认为可以更加有效的终止转录。
有一点特别需要注意的是，哺乳动物细胞的poly(A)信号和病毒包装系统的联合使用可能会降低病毒滴度，延长转录本的寿命，所以处理的时候需要谨慎一点。因为这个原因，病毒载体通常会使用其他非poly(A)的转录本稳定元件和出核元件，如WPRE和CTE或者使用其他弱的poly(A)信号，如BGH 。

原核细胞和真核细胞的聚腺苷酸化

聚腺苷酸化一般认为是真核细胞特有的加工过程，但是原核细胞中它也会在RNA产物的末尾加上聚腺苷酸。与真核细胞不同的是，在真核细胞中poly(A)通常加在特定的poly(A)信号位点处，而在原核细胞中这个位点不是特异的，比较随机。poly(A)尾巴会加快RNA的降解，这一点与真核细胞也是不同的。由于加poly(A)尾没有特异性，所以poly(A)尾通常被认为是用来调节细胞内的RNA浓度水平，并作为一种质量控制机制来清楚错误折叠的RNA。