【文献分享】核蛋白GBPLs通过相分离调控植物免疫

写在前面
    本次分享一篇2021年发表在Nature上的有关相分离的文章，“A phase-separated nuclear GBPL circuit controls immunity in plants”，主要讲述了植物的一对GTPase-like蛋白，在植物面对病原菌入侵时，通过液液相分离的方式调控防卫基因的表达，从而增强植物的免疫反应。

Abstract

    液液相分离对于我们理解无膜器官的区室化提供了一个很好的范例。作者报道了一类GTPase家族-GBPLs(guanylate-binding protein (GBP)-like GTPases)，在细胞核内通过液液相分离驱动的积聚来应对侵染和自发免疫。GBPL1，一个假的GTPase，在正常情况下隔绝有催化活性的GTPase-GBPL3；当免疫信号进核时，被GBPL3通过液液相分离给取代。我们通过冷冻原位电子断层扫面观察到，唯一的无膜器官形成，我们称为GDACs(GBPL defense-activated condensates)。中等规模的GDAC形成后，GBPL3直接结合到防卫基因的启动子区，招募特定的转录共激活蛋白和RNA聚合酶II来重编码防卫基因的表达。

Introduction

    植物在面对病原菌时，有关PTI和ETI的研究已经很多了，而液液相分离如何参与植物免疫还研究的不多，因此作者进行了探索并提出如下证据。

Results

1. IDR-containing GBPLs confer plant defence

    蛋白质组分析拿到GBPLs蛋白。遗传学上发现，gbpl3比WT更感病；gbpl1-1比WT更抗病，双突变的表型和gbpl3的无差异，并且GBPL3-OX和GBPL1的表型时相似的(F1abcd)，这就暗示着GBPL1可能负调GBPL3介导的免疫来阻止自发免疫。RNA-seq分析GBPL3-OE和GBPL1-KO的差异基因(均以Col-0做对照)，上调的基因有95%是重合的；下调的基因有92%是重合的(F1e)，这与表型是吻合的。综上，GBPL3调控了防卫基因的表达。

F1 IDR-containing GBPLs are essential for plant defense.png

2. Defence signals trigger GBPL3 condensates

    细胞组分定量发现，GBPL3在胞质和细胞核都有存在，核定位的GBPL3直接结合到GBPL1和染色质上；核酸酶保护试验和NaCl洗脱试验(常染色质富集基因在150mM和300mM被洗脱，异染色质富集基因在600mM被洗脱)表示，GBPL1和GBPL3在150mM和300mM都能被洗脱，而只有GBPL1在600mM被洗脱(F2A)，且在gbp1突变体背景下，300mM洗脱下来的GBPL3更多，也就是结合常染色质的GBPL3更多。这就说明，正常情况下，GBPL1可能阻断了GBPL3的功能，或者GBPL1以一种更高亲和力的方式来限制防卫基因的表达。
    外源施加SA处理增加了GBPL3在核的累积，但是总蛋白量没变(F2b)。GBPL1的定位和蛋白量不受SA的处理而变化；受到病原菌侵染时，GBPL3细胞核的浓度增加，总蛋白量没有变化。因此，免疫激活可能触发了GBPL3向核运输来推翻GBPL1的抑制作用。
    实时荧光观察发现，SA处理激发了GBPL3在核的积聚(F2c),这种现象也可由哌啶酸(pipecolic acid)和病原菌诱导产生，而flg22或chitin却不能诱导这种现象发生。他们把这种结构称为GDACs(GBPL defence-activated condensates)。

F2 defense activation triggers a GBPL1-GBPL3 chromatin switch for immune condensates in the nucleus.png

3. GDACs are assembled by LLPS

    叶片核细胞光漂白试验发现，植物内部交换材料，GBPL3在200-250s光漂白荧光恢复，这与动物中报道的发生恢复的时间基本一致(F3abc)。
    为了查明GDACs是否直接通过液液相分离组装，作者在体外构建了GFP-GBPL3。外源施加Ficoll(相分离的诱导剂)能够诱导GBPL3积聚。为了查看GBPL3是否在原位聚集，使用293细胞系表达GFP-GBPL3，冷冻原位电子断层扫面观察发现，GDACs聚集成蛋白簇(F3ef)。

F3 Arabidopsis GBPL3 immune condensates are assembled via LLPS.png

4. GBPL3 IDR and GTPase activities in LLPS defence

    GBPL3具有IDR结构域，删除后，GBPL3不能形成GDAC。单独的IDR结构域能在体外发生相分离，体内不可以。GBPL3的N端包含经典的GTP结合口袋，P-loop区突变后，破坏了其GTPase活性和相分离的能力。因此，IDR和GTPase的催化结构域对于GBPL3发生相分离是不可或缺的。

5. GDACs coordinate defence-gene transcription

    非变性条件的ChIP发现，GBPL3直接结合到11个防卫基因的启动子区(F4A)。细胞核IP发现GBPL3能够和CDK8(转录的负调因子，通过阻止RNApolII结合中介体亚基发挥作用)，多个中介体亚基互作，共同组成复合物发挥转录激活功能(F4B)。活细胞成像发现，GBPL3与多个中介体亚基共同发生相分离，而把CDK8排除在外(F4c)，因此GBPL3的相分离行为创造了一个无CDK8的环境来帮助保护RNA聚合酶2和中介体亚基的互作免受抑制， 从而促进了防卫基因的表达。

F4 GDACs concentrate RNAPII conactivators and nuclear GBPL3 on promoters of Arabidopsis defense genes.png

后记
1.看完这篇文章说实话我有点后悔，因为他的有些结果和他的结论并不match，而且有些结论下的比图出现的要早。如F2a；

2.长难句是真的多，要不推荐给考研命题组当试题吧。

3. 角度和技术都是很新颖的，但是拿国内实用主义的眼光来看，意义就显得不大了。