PRRC2C CKO鼠的构建
date：2021-10-14
author：余顺太
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5' arm的生成
5KoxaV.png
以genomic DNA为模板，通过PCR从其上面 P下来5' arm，同时在5' arm两端加上SalI和HindIII的酶切位点，引物，引物Tm值，产物大小，PCR条件如下：
Prrc2c-SalI-F: ACGCgtcgaCACAAAAGCCAAGGATGGGAAGAAG 15779 67.0 1242bp
Prrc2c-HindIII-R: GATaagcttcggtcgtCCCCTTAACTTCTAAATATGGAACACT 17020 60.8
98℃ 10sec 60℃25sec 72℃50sec 37cycles
3' arm的生成
以genomic DNA为模板，通过PCR从其上面 P下来3' arm，同时在3' arm两端加上BamHIa和NotI的酶切位点，引物，引物Tm值，产物大小，PCR条件如下：
Prrc2c-BamHI-F: GATggatccgctacgACTGCCTCCTCTCCCACCCTGTTC 17994 68.8 1381bp
Prrc2c-NotI-R: GGAAAAgcggccgcACAGGCCATGTCTGTTGTTCCTTAATTC 19374 67.2
98℃ 10sec 66℃25sec 72℃50sec 37cycles
target exon两端加上loxp
target exon sequence两端加上loxp分成两轮PCR反应来进行：
第一轮PCR反应：以genomic DNA为模板，通过 Prrc2c-HindIII-loxp1-F1 和 Prrc2c-BamHI-loxp2-R1 引物对进行PCR扩增，使target gene一端带上loxp1的部分序列，另一端带上loxp2的部分序列（之所以只带上loxp部分序列而没有全部带上，是因为如果带上全部loxp序列，再加上binding在genomic DNA上面的序列，引物将会巨长，超长引物会导致与之相匹配的退火温度以及延伸温度增加，若该温度超过了DNA聚合酶的最佳延伸温度，则产物特异性会很差。同时引物太长合成亦不方便，成本更高。所以只带上部分loxp序列，loxp剩下的部分再通过第二轮PCR带上）；
Prrc2c-HindIII-loxp1-F1: TGTATGCTATACGAAGTTATcgagaCAACATGAAGCTATTTTCCCACTTTCAC 16849 66.0
Prrc2c-BamHI-loxp2-R1: CATACATTATACGAAGTTATggcgtcGGTACAGGCTATGCAGTGTAAGTAAACCTG 17991 66.6
98℃ 10sec 64℃25sec 72℃40sec 37cycles
genomic DNA 和 loxp1之间的 cgaga 以及genomic DNA 和 loxp2之间的 ggcgtc 主要有两个作用；第一个目的是破坏sgRNA在目的产物中的结合位点；还有一个作用就是通过引入外源碱基，增加GC含量，使之与screen鉴定引物更加高度匹配，且结合更强。如下图所示，如果没有 ggcgtc 则 T7-prrc2c-18006r-gRNA-F会与目的产物中loxp和的target exon之间的结合部分进行binding，进而对我们的目的产物进行切割，这是我们不想看到的，但是ggcgtc的存在使该位置的序列和sgRNA不再匹配，成功避免了目的产物被sgRNA切割的命运。（这只是我自己认为的，因为 Prrc2c-HindIII-loxp1-F1 引物中的 ggcgtc这样解释不通。 ）
第二轮PCR反应：以第一轮PCR反应的产物为模板，通过 Prrc2c-HindIII-loxp1-F2 和 Prrc2c-BamHI-loxp2-R2 引物对进行PCR扩增，此次PCR反应使 target exon sequence 一端带上完整 loxp1 序列和Hind III酶切位点，另一端带上完整 loxp2 序列和BamHI酶切位点 。
Prrc2c-HindIII-loxp1-F2: GATaagcttATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATcgagaCAACA
Prrc2c-BamHI-loxp2-R2: GATggatccATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATggcgtcGGTAC
经过以上的两轮PCR反应，target exon两端加上loxp生成如下图所示的Part II。然后如图中所示：5' arm（即Part I），Part II，3' arm（即Part III）连接起来，形成一个整体，我们将其命名为recombinant nucleotide，将其与两个sgRNA（分别是T7-prrc2c-16867r-gRNA-F 和 T7-prrc2c-18006r-gRNA-F）和 Cas9蛋白一起注射进胚胎，两个 sgRNA 起 GPS 定位功能，而Cas9蛋白去进行切割，将这两个sgRNA的序列mapping回genomic DNA可以看到中间夹的是第3个外显子（如红箭头所示），在Snapgene上可以看到该外显子碱基个数为178bp，该178bp不能被3整除，Cre-loxp生效使之切掉之后会发生移码突变，导致基因失效。这两个sgRNA的信息如下：
T7-prrc2c-16867r-gRNA-F: TTAATACGACTCACTATAggaaaatagcttcatgttggGTTTTAGAGCTAGAAATAG
T7-prrc2c-18006r-gRNA-F: TTAATACGACTCACTATAggagaggaggcagtatggtacGTTTTAGAGCTAGAAATAG
5M6xBD.png
5MEAOA.png
被两个loxp夹住的外显子被sgRNA切掉之后，中间产生一个缺口，recombinant nucleotide的5' arm和缺口左端同源，recombinant nucleotide的3' arm和缺口右端同源，然后同源重组，recombinant nucleotide就进入到了genomic DNA里面，这就获得了flox小鼠。
小鼠基因型鉴定
鉴定loxp1的引物，下面这对引物都是binding在genomic DNA上面，loxp1位于这对引物的中间，
Prrc2c-16867r-seq-F: TCCACAATGATAACACTTCCTCCAACAG 16715 66.8 322bp
Prrc2c-16867r-seq-R： AACCCACCCACCAGAACCCCTT 17036 67.5
鉴定loxp2的引物，下面这对引物都是binding在genomic DNA上面，loxp2位于这对引物的中间，
Prrc2c-18006r-seq-F: TGAGTTCAGTAGCATTAGCCATAAGCACAG 17912 67.8 217bp
Prrc2c-18006r-seq-R: GCATCTTGGAATTTAGGCAACAGAACC 18128 67.7
```
最开始的一两代小鼠要用screen引物进行鉴定，这样可以P出大片段，准确确定插入正确性，黑粗碱基是与前面讨论的 cgaga 和 ggcgtc 对应的。
Prrc2c-CKO-screen-nF1: ATAGAGAGAGGCGGAGGGGGCTT 15390 67.8
Prrc2c-CKO-screen-nR1: AGTGGGAAAATAGCTTCATGTTGTCTCG 16871 67.5 1482bp
Prrc2c-CKO-screen-R2: GGTGGGAGAGGAGGCAGTCGTAGC 18011 69.4 2621bp
Prrc2c-CKO-screen-nF3: TGGATCAGGCCAGCCTCATTGTC 16832 69.3 2637bp
Prrc2C-CKO-screen-F4: CACTGCATAGCCTGTACCGACGCC 17974 68.2 1495bp
Prrc2c-CKO-screen-R3: TAGGAGGATTTCTGTAAAAGACATTTGGGA 19468 67.4
