13.GEO数据集的R语言差异分析和代码解析--2.差异分析

2021-07-11 本文已影响0人 NiKasu

一、举例回顾

本节下载GSE1009数据集，使用limma包进行差异分析举例。

GSE1009

样本量：共6个样本，其中后3个为糖尿病肾病(DN)肾小球样本，前3个为正常肾小球样本。

使用芯片：Affymetrix Human Genome U95 Version 2 Array。

平台：GPL8300。

二、需要准备的文件：

上一节中保存的GSE1009.Rdata和GSE1009expressionmetrix_GSE.csv（请把这两个文件放在一个文件夹中。）

三、差异分析代码解析：

>setwd("D:\\Rfile")

>rm(list = ls())

>options(stringsAsFactors=F)

#老规矩，先设置工作目录。

>load(file = 'GSE1009.Rdata')

#加载上一节保存的R文件，里面包含表达矩阵和分组信息，不记得了可以看看上一节代码。

>table(group_list)

#计数每组样本的个数。

>library(limma)

#调用limma包，注意调用包之前，请先安装。

#limma包是biocondutor中的包，搜索安装命令的方式见上一节，这里就不重复了。最新的安装命令如下：

>logFoldChange=1

>adjustP=0.05

#设置差异基因DEGs的筛选阈值。

#关于筛选阈值：一般有三个筛选条件，log2FC、P、FDR(调整的P),大家可以根据自己的需要设置。

>rt=read.csv("GSE1009expressionmetrix_GSE.csv")

#读取整理好的表达矩阵数据，读入R中的矩阵的数据结构为列表，将整个列表赋值给变量rt.

>rt=as.matrix(rt)

#将列表rt转换为矩阵。

#这时表达矩阵如下：

注意行名

>rownames(rt)=rt[,1]

#将第一列数据（基因名）作为行名。

再看看行名，已经变了

>exp=rt[,2:ncol(rt)]

#选择第2列到最后一列，即表达矩阵，并赋值给exp。这样就得到行名为基因名，列名为样本名的矩阵。

>dimnames=list(rownames(exp),colnames(exp))

#提取出exp的行名和列名。这里的dimnames就是矩阵创建matrix里面的参数，在数据结构矩阵那一节有讲。

>rt=matrix(as.numeric(as.matrix(exp)),nrow=nrow(exp),dimnames=dimnames)

#合并整个矩阵，得到一个行名为基因名，列名为样本名的表达矩阵。

>modType=c(rep("Control",3),rep("DN",3))

#构建分组模型，根据GSE1009样本的排列，前3个为正常样本，后3个为糖肾样本，构建一个分组的向量模型。

>design <- model.matrix(~0+factor(modType))

>colnames(design) <- c("Control","DN")

#创建线性模型。

#注意这里，在构建模型时，有一些数据集的处理组在前，对照组在后，且因为R里面默认的字符存储顺序为字母表顺序，如果处理组的首写字母的顺序在对照组的后面，构建模型时前三个又是处理组，那design出来的结果会上下调就完全相反。所以如果是这种情况的话，需要定义因子顺序。如：“modType=c(rep("DN",40),rep("Control",40))

design <- model.matrix(~0+factor(modType,levels = c("DN","Control"),ordered = F)).”

>fit <- lmFit(rt,design)

>cont.matrix<-makeContrasts(DN-Control,levels=design)

>fit2 <- contrasts.fit(fit, cont.matrix)

>fit2 <- eBayes(fit2)

>allDiff=topTable(fit2,adjust='fdr',number=200000)

#贝叶斯检验。

>diffSig <- allDiff[with(allDiff, (abs(logFC)>logFoldChange & adj.P.Val < adjustP )), ]

#根据筛选条件筛选出差异基因。

>diffUp <- allDiff[with(allDiff, (logFC>logFoldChange & adj.P.Val < adjustP )), ]

#筛选上调的基因。

>diffDown <- allDiff[with(allDiff, (logFC<(-logFoldChange) & adj.P.Val < adjustP )), ]

#筛选下调的基因。

##如果想把这些基因的结果输出，可以用write.table函数write.table(diffUp,file="up.xls",sep="\t",quote=F,row.names=F)，要基因名字就把参数row.names设置为T.

##绘制热图

>group<-modType

#设置热图的分组。

>group<-as.data.frame(group)

>rownames(group)<-colnames(rt)

#按照分组，将rt的列名改为DN或control

>heat<-rt[rownames(rt) %in% c(head(rownames(subset(diffSig,diffSig$logFC>0)),20),head(rownames(subset(diffSig,diffSig$logFC<0)),20)),]

>library(pheatmap)

>x <- t(scale(t(heat)))

>pheatmap(x,annotation_col=group)

#绘制前20个基因的热图，自己调整基因数、图形颜色等等。

这里GSE1009的热图就绘制成功，实际处理时大家可根据自己的需求调整图形参数。

##绘制火山图

>png(file="火山图.png",width = 600,height = 600)

#设置图片格式

>yMax=max(-log10(allDiff$adj.P.Val))

#定义y轴最大值

>xMax=max(abs(allDiff$logFC))

#定义x轴最大值

>plot(allDiff$logFC,-log10(allDiff$adj.P.Val), xlab="logFC",ylab="-log10(adj.P.Val)",main="Volcano", xlim=c(-xMax,xMax),ylim=c(0,yMax),yaxs="i",pch=19, cex=1.2)

#绘图

>diffSub=subset(allDiff, adj.P.Val<adjustP & logFC>logFoldChange)

>points( diffSub$logFC,-log10(diffSub$adj.P.Val), pch=19, col="red",cex=1.2)

#修改上调基因的图形参数

>diffSub=subset(allDiff, adj.P.Val<adjustP & logFC<(-logFoldChange))

>points(diffSub$logFC,-log10(diffSub$adj.P.Val), pch=19, col="green",cex=1.2)

#修改下调基因的图形参数

>abline(h=-log10(adjustP),lty=2,lwd=2)

>abline(v=c(-1,1),lty=2,lwd=2)

#拼接图形

>dev.off()

#返回终端。