§新毕设:GSH的RNAi|1

2019-02-25  本文已影响0人  梅胜

1、扩增

(PCR)

2、跑胶

(制备1%的琼脂糖凝胶,取产物5微升点样,电泳,照相)

图片见电脑D盘悦姐文件夹下

3、乙醇沉淀

(100微升体系:10微升3mol乙酸钠;80微升产物,10微升水,水加不加根据产物的量灵活变化)

加250微升无水乙醇,共350微升

12000rpm离心15分钟,弃上清,顺离后,吸取上清,干燥,加50微升水充分混匀溶解。

仪器测得片段浓度分别为189;132纳克/微升

4、酶切

(50微升体系:5微升10×Buffer,

片段1微克,根据测得的浓度即换算为7微升片段;对应双酶切KPN1、BAMH1各0.5微升,剩余用37微升水补足)

后置于37℃培养箱酶切


1、菌落PCR:

体系无异,模板有异。

模板制备:加30微升无菌水,牙签划取少量单克隆插入离心管,拔出牙签;后吸取1微升加入19微升的体系中,PCR。

2、热激:

过夜培养的连接产物3微升?放入30微升感受态细胞中,冰上静置30分钟;

42℃热激30s,随即冰上放置2分钟;

加无菌培养基900微升,37℃恒温摇床放置1h后取出,

6000rpm离心3分钟,弃上清,留100微升菌体,超净工作台重悬(移液枪操作),涂布培养基(先加小玻璃珠,后加菌体)。

37℃倒置过夜培养。

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