NGS002 核苷酸

核苷酸结构

• 核酸单体的核心结构是核苷酸，它由一个糖残基及一个含氮碱基组成
• 根据核糖类型的不同，分为核苷三磷酸，脱氧核苷三磷酸（核糖2’脱氧），双脱氧核苷三磷酸（核糖2’，3’脱氧）
• 根据核苷酸5’位置所含磷酸基团的多少，分为核苷单磷酸，核苷二磷酸，核苷三磷酸。

• 根据核苷酸的碱基不同，其中DNA有四个含氮碱基腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G），胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）。而RNA则有腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G），胞嘧啶（C）及尿嘧啶（U）

  
  核苷酸单体结构
  嘌呤及嘧啶
  甲基化碱基
  不可水解核苷酸

DNA合成

合成机理

作为合成DNA和RNA的单体所需的核苷酸是高能核苷三磷酸。在将核苷酸掺入聚合物结构的过程中，每个三磷酸酯的两个磷酸基团（Pi-Pi，称为焦磷酸酯）从进入的核苷酸上裂解下来，并在反应过程中进一步水解，剩下的核苷单磷酸被掺入正在生长的RNA或DNA链中。进入的三磷酸核苷的掺入是通过生长中的DNA聚合物3'-OH的亲核攻击来介导的。因此，DNA合成是定向的，仅发生在分子的3'端。
焦磷酸（Pi-Pi）的进一步水解释放出大量能量，从而确保整个反应的负ΔG值。Pi-Pi –> 2Pi的水解ΔG= -7 kcal / mol，对于提供DNA合成反应的整体负ΔG（-6.5 kcal / mol）至关重要。焦磷酸盐的水解还确保了不会发生逆反应，从而从生长中的DNA链中除去新掺入的核苷酸。
该反应在DNA中由称为DNA聚合酶的一系列酶介导。同样，RNA聚合酶是RNA合成所必需的。

DNA合成机理

DNA与RNA合成区别

复制和转录被称为合成DNA和RNA的两个主要过程。 DNA的合成或复制是通过展开双链而发生的，两条链都产生子双链DNA。 该过程主要涉及DNA聚合酶以及其他酶。 RNA合成使用一条DNA链使用RNA聚合酶合成RNA。 两者均沿5'到3'方向进行。

DNA合成
RNA合成

DNA双螺旋的结构

（A）A-T碱基对和（B）G-C碱基对的顶视图显示了DNA大沟和小沟的形成。（C）DNA双螺旋的侧视图，标出大沟和小沟。DNA主链以绿色显示，潜在的氮氢键位置显示为蓝色，氧氢键位置显示为红色。

双螺旋结构

染色体与包装

染色体结构

在真核细胞中，DNA被组织成长线性染色体结构。染色体是具有生物的部分或全部遗传物质（基因组）的脱氧核糖核酸（DNA）分子。大多数真核染色体都包含包装蛋白，这些蛋白在分子伴侣蛋白的帮助下与DNA分子结合并凝缩，以防止其变成难以处理的缠结。在典型的细胞分裂之前，这些染色体在DNA复制过程中被复制，从而为每个子细胞提供了一整套染色体。染色体的复制臂称为染色单体。在有丝分裂期间被分离成子细胞之前，复制的染色单体通过称为着丝粒的染色体结构保持在一起。

复制和浓缩的真核染色体图。①染色单体；②着丝粒；③短臂p；④长臂q

组蛋白

• 核心组蛋白
  组蛋白是在真核细胞核中发现的高度碱性的蛋白质，可将DNA包装并排列成称为核小体的结构单元。它们是染色质的主要蛋白质成分，充当DNA缠绕的线轴，并在基因调控中发挥作用。如果没有组蛋白，染色体上未解链的DNA将非常长（人类DNA的长宽比超过1000万比1）。例如，每个人类二倍体细胞（包含23对染色体）都具有约1.8米的DNA。缠绕在组蛋白上的二倍体细胞具有约90微米（0.09毫米）的染色质。
  组蛋白共用五种：H1/H5，H2A，H2B，H3和H4。其中H2A，H2B，H3和H4被称为核心组蛋白，而组蛋白H1/H5被称为接头组蛋白。
  核心组蛋白都以二聚体形式存在，它们的相似之处在于它们都具有组蛋白折叠域：通过两个环相连的三个α螺旋。正是这种螺旋结构允许不同二聚体之间的相互作用，特别是以头尾形式（也称为握手图案）。然后将所得的四个不同的二聚体聚集在一起以形成一个八聚体核小体核心，其直径约为63 A。大约146个碱基对（bp）的DNA以左手的超螺旋形圈绕此核心粒子缠绕1.65次，从而产生约100 A跨度的粒子，称为核小体。

  
  核小体核心结构。组蛋白H2A和H2B二聚，组蛋白H3和H4二聚。其中各两个二聚体连接形成一个组蛋白核心八聚体。DNA双螺旋围绕八聚体核心缠绕1.65倍，形成核小体结构。

• 接头组蛋白
  接头组蛋白H1在DNA的入口和出口位点结合核小体，从而将DNA锁定到位并允许形成更高阶的结构。最基本的形式是10 nm纤维或珠子呈线状构象，也即是将DNA包裹在核小体周围，并用大约50个碱基对的DNA分开每对核小体（也称为连接子DNA）。

  
  整体核小体结构
  染色体组装

核苷酸修饰

碱基荧光标记dNTP

可逆及不可逆荧光标记dNTP

• Sanger测序使用的ddNTP，3’位置为H，无法与核苷酸5’位磷酸基团形成磷酸二酯键
• 二代测序常用的是上图中的B结构（如illumina及MGI），3’可逆阻断终止子，其中3’位阻断基团可以为氨基或是叠氮基团，在测序信号采集完成后，可以切除3’blocker及碱基上的荧光标记，从而使得DNA链能够继续延伸（每次延伸一个碱基）

• 由于在切除荧光标记的同时，会在碱基上残留linker，随着链的延伸，大量的linker会造成延伸链聚合效率的降低，最为典型的就是测序过程中的“马拉松效应”（MGISEQ称为lag/Run on，illumina称为Phasing/prephasing）。

  
  illumina测序DNA合成残基示意图
  常用商业化荧光标记dNTP

磷酸基团荧光标记dNTP

Pacbio SMRT测序采用的dNTP，其荧光基团标记在磷酸基团，荧光基团会随磷酸基团一起脱落，由于该过程十分接近核酸的天然合成状态，所以合成速度极快（约为100bp/s）。Pacbio测序使用的phi29 DNA聚合酶是一种高保真，最大可扩增100kb长度的聚合酶，目前主要用于全基因组扩增，单细胞测序等。

磷酸集团荧光标记

非荧光标记dNTP

华大智造在2019年3月美国AGBT大会上发布了一种新的核苷酸标记技术-CoolMPSTM，该技术也是基于3’-O blocker reversible terminator，但是4种荧光是标记在了可特异性识别3’-O blocker碱基的抗体上，当测序结束，采集完荧光信号以后，3’-O-blocker被切除，荧光标记会随抗体一起脱落，这样碱基就变成了天然无修饰的状态引入DNA链，也就说CoolMPSTM确实是一种无损碱基合成技术

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