PCR退火温度预测

  一般，PCR包括三个步骤：1）高温使DNA变性，打开双链；2）降温使引物与模板复性，形成起始聚合过程的局部双链；3）在聚合酶作用下，dNTP持续加载到引物末端，完成新生链的延伸。其中，退火过程中温度是非常重要的一个参数，温度过高产量降低甚至得不到产物，温度过低又会导致非特异扩增。所有的引物设计软件都会给出预测的退火温度，引物合成公司的合成单中也会有退火温度的信息，大名鼎鼎的公式：Tm=2×（A+T）+4×（G+C）用了十几年，现在还有公司在用。这个公式准确吗？有新的计算方法吗？
  实际上，我们通常所说的退火温度Ta（Annealing Temperature）与Tm（Melting Temperature）是不同的概念，Tm是DNA变性过程中的概念，Ta是DNA复性过程中的概念。最早计算Tm的方法都是研究DNA杂交时提出的，那时候还没有PCR这个概念。但DNA的变性和复性互为可逆过程，退火时DNA解链状态与温度的关系与变性时相同，因此可以用Tm代替Ta，下文讨论时不再区分Tm与Ta。

1. Tm的测量方法
   

     Tm是怎么测的呢？紫外吸收。DNA从双链变为单链的过程中，在260nm处的紫外吸光系数会增加（增色效应），参见下图。 生化（第三版） 基于这一原理，假设单链DNA和双链DNA在260nm处吸光度系数不随温度变化，当我们用两条完全互补的引物作为研究对象，将DNA完全处于单链状态时的吸光度定义为As，将DNA完全处于双链状态时的吸光度定义为Ad，将引物中处于双链状态的比例定义为f，那么当温度T处于变性范围内时，存在关系： 当f=1/2时，所对应的温度即为Tm，此时A(Tm)=1/2(As+Ad)，可参见下图。 熔解状态与吸光度值   上面介绍了怎么通过实验检测寡核苷酸的Tm，这种方法叫紫外吸收法，还有一种方法叫差示扫描量热法（differential scanning calorimetry, DSC），通过测量变温过程中的热力学和动力学参数，推算f值。
2. 怎么计算Tm
     需要先思考一下寡核苷酸变性和退火的微观过 。我们都知道维系核酸双链结构的主要作用是氢键，变性和退火也就是氢键断裂与形成的过程，必然也就伴随着热量的吸收与释放。化学键的变化可以用熵、焓、自由能参数来计算， 因此引物的Tm同样能够用熵、焓、自由能参数来计算。文献中有很多计算模型，其中最著名的方法就是NN模型（Nearest-Neighbor model）[2]，即将寡核苷酸中最邻近的两个碱基作为一个单位，统计寡核苷酸链中所有单位的标准焓变和熵变的和，通过公式（1）： 计算寡聚核苷酸的Tm，式中∆H表示所有NN邻近碱基对的标准焓变的和，∆S表示所有NN邻近碱基对的标准熵变的和，R为摩耳气体常量，c表示引物的浓度。每对碱基的∆H和∆S数据参见Breslauer等的研究[4]，需要注意的是这些数据是在1M NaCl浓度下测量的，并且一直在被不同的研究人员更新，我在后面还会讨论。
3. Tm的影响因素

• 单价阳离子浓度
    在PCR体系中影响核酸双链氢键的因素包括带电离子和添加剂，其中单价阳离子有很重要的作用。NN模型中，计算引物Tm的碱基对的焓变、熵变数据都是在1M NaCl浓度下测量，而PCR缓冲液中的单价阳离子包括K⁺、Tris⁺等，浓度都不高，这对引物的Tm影响很大。Baldino等[5]用16.6×lg[K⁺]来修正离子浓度，这个参数是在研究长链探针时提出的，现在已经发生了较大变化，总体上Tm随总单价阳离子浓度的升高而升高，Tm与单价阳离子的对数呈正相关。Owczarzy等[12]使用92对互补引物在69mM-1.02M氯化钠盐溶液中的Tm，系统研究了两者的关系，发现Tm与ln[Na⁺]之间存在非线性相关，最后提出了经验性的Tm与ln[Na +]之间的二次函数关系，经过这一修正能够更为准确的预测引物的Tm。（Owczarzy教授对寡核苷酸的Tm计算有深入研究，并编写了一些Tm预测软件，具体可参见其个人网站：http://www.owczarzy.net/）
• 镁离子浓度
    镁离子是PCR必需的辅离子，在一般PCR体系中的终浓度为1.5-2.5mM，在反转录PCR中需要更高的浓度。虽然Mg²⁺的浓度很低，但对引物的Tm却有重要影响。实际上单从离子的电价来看，Mg²⁺对Tm影响就比单价阳离子更大，Mitsuhashi等（Mitsuhashi M. Technical report: Part 1. Basic requirements for designing optimal oligonucleotide probe sequences[J]. Journal of clinical laboratory analysis, 1996, 10(5): 277-284.）在研究探针Tm时，为了提高准确性引用了16.6×lg[Na⁺]修正，其中考虑了Mg²⁺的影响，两者之间可以按[Na⁺]=4×[Mg²⁺]^0.5换算。Wetmur等[14]也使用[Na⁺]=4×[Mg²⁺]^0.5校正单价阳离子浓度。Nicolas等[11]进一步考虑了dNTP的影响，提出使用经验关系式：[Na⁺]=120×([Mg2+]-[dNTP])^0.5对镁离子和单价阳离子进行换算。虽然不同研究得出的换算公式有差异，但单价阳离子与镁离子平方根成正比的关系式得到较一致的认可。
• GC含量
    研究发现在一定离子浓度条件下，引物序列中GC含量越高，Tm越大。这不难理解，GC碱基对之间形成三个氢键，比AT碱基对要牢固一些，因此双链中G或C越多，双链的稳定性也就越高。很多研究中使用0.41×（G%+C%）来校正Tm（[11]）。
• 引物浓度
    从公式（1）中可以看到引物浓度c是Tm的直接影响因素，但一般PCR反应体系中c的有效取值范围极低（uM级，考虑模板浓度有效取值可能在nM级），因此一般可以不予考虑。
• 序列长度
    引物的长度对其Tm也有很大的影响，经典公式（2）：Tm=2×（A+T）+4×（C+G）主要用于预测14-20bp的短寡核苷酸，研究核酸杂交的Tm时，提出使用-675/N（N代表寡核苷酸碱基数）校正Tm。这一参数也在不断变化，Nicolas等[11]的报道了不同研究中对引物长度的校正参数。
• 添加剂
    PCR添加剂能够改善扩增效率和特异性，像DMSO、甲酰胺、甘油、甜菜碱等，能够改变引物与模板的退火温度，从而提高产物特异性。其中研究比较明确的是DMSO和甲酰胺，一般认为体系中每加入1%的DMSO Tm降低0.5-0.75（[11]），每加入1%的甲酰胺Tm降低0.6-0.7（[3]、[14]），每加入1%的甘油Tm降低0.25（[14]），每加入1%的乙二醇Tm降低0.4（[14]）。

4. Tm计算公式
     最早预测寡核苷酸Tm的研究主要是针对核酸杂交的，计算对象大多是核酸探针，PCR发明以后开始将Tm用于指导PCR的退火（早期认为取Td=Tm-5-10℃）。基于NN原则科学家们建立了Tm的估算公式，随着研究的深入提出各种各样的修正，使Tm的预测越来越准确，但PCR最佳退火温度的影响因素复杂多变，抛开具体的体系和条件，找到一个统一的计算公式是不现实的。从本文罗列的文献中不难看出，Tm的计算公式简直让人眼花缭乱，仅文献[11]中就介绍了12个计算公式，但无论这些公式怎样变化，都还是具有一些一致性的，他们的基本模式为：①基本Tm就是通过公式（1）计算出来的，因为采用的熵焓数据集不同，计算结果也有差异，文献[10]和[13]比较了不同数据集的准确性，都认为SantaLucia[7]和Sugimoto[8]的结果比较准确，本文推荐使用SantaLucia的结果：

②离子校正通过16.6×lg([Na⁺]+4×[Mg²⁺]^0.5)，所有离子浓度均为mol/L；③GC校正通过0.41×(G%+C%)，G%和C%分别代表G和C的占比×100；④添加剂校正：0.75×DMSO%或者0.65×甲酰胺%或者0.5×甘油%（我通过实验得到的数据为0.4-0.5，与Wetmur的0.25不同）

5. Tm与PCR特异性

• 梯度PCR
    梯度PCR是寻找最佳退火温度最简便的方式，利用梯度PCR仪上的基座BLOCK模式，每个孔都可以设置不同的退火温度，进依靠一次实验就能找到最佳的退火温度，现在市场上大多PCR以都支持梯度设置。
• 降落/上升PCR
    降落/上升PCR是一种PCR进程依赖性改变退火温度的程序，随着循环数的增加，退火温度和时间可以逐渐的增加或降低，从而特异性的增加目标产物的比例。假设引物可能有多个退火位置，但是他们的最适Tm不同。当模板浓度较高时，如果将退火温度设置为比最高Tm更高的温度，那么拥有最高Tm的位点就会最先得到扩增，次级扩增位点可能在几个循环之后才开始扩增，这样随着循环数的增加目标条带与非特异性条带的差异就会越来越大，相对的提高了产物的特异性。当模板浓度较低时，可以将退火温度设置的比Tm低，通过前几轮PCR，低浓度模板得到富集，随着循环的增加Tm不断升高，次级产物就会逐渐减少，从而提高目标条带的比例。
    通过PCR程序提高产物特异性是一种常用方法，但不是唯一方法，聚合酶、引物设计、模板具有更重要的影响，以后介绍聚合酶时还会讲，文献[16]、[17]介绍了降落PCR的效果和步骤，感兴趣的同学可以去看一看。

6. Tm在线计算网站

• OligoCalc：是一款多功能寡核苷酸计算器，可以指定引物浓度和钠离子浓度，还允许指定引物修饰，输出引物的Tm，GC%，length，分子量等信息，适合探针类引物的Tm预测。
• IDT：IDT公司推出的引物分析工具，可以指定引物浓度、钠离子浓度、镁离子浓度、dNTP浓度，输出Tm、长度、GC%等，还可以分析引物的发夹结构，设计引物，功能比较全。该工具计算出的Tm值偏高，实际使用时可以降低2-4℃。
• dnaMATE：界面简洁，可以指定引物浓度和盐离子浓度，支持多序列输入。
• Tm：简洁到简陋，我本人编写的一款计算工具，考虑了添加剂校正，现在市场上一些高保真的聚合酶缓冲液中大多含有DMSO或甘油，因此计算值可能稍微偏低，我自己通过实验验证一般能够得到较高产量，对于特异性差的引物可以提高3-5℃。

[1] Martin, F. H., Uhlenbeck, O. C., & Doty, P. (1971). Self-complementary oligoribonucleotides: Adenylic acid-uridylic acid block copolymers. Journal of Molecular Biology, 57(2), 201–215.
作者使用一种能够自身互补的引物，研究了引物浓度、焓变和温度等因素的关系，文中介绍了测量Tm的方法。
[2] Borer P N, Dengler B, Tinoco Jr I, et al. Stability of ribonucleic acid double-stranded helices[J]. Journal of molecular biology, 1974, 86(4): 843-853.
文中提出了著名的NN模型，给出了计算Tm的熵焓公式。
[3] Meinkoth J, Wahl G. Hybridization of nucleic acids immobilized on solid supports[J]. Analytical biochemistry, 1984, 138(2): 267-284.
文章研究了退火温度和退火时间，提出了著名的Tm=2×（A+T）+4×（G+C）以及退火时间与引物浓度、长度之间的函数关系。
[4] Breslauer K J, Frank R, Blöcker H, et al. Predicting DNA duplex stability from the base sequence[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1986, 83(11): 3746-3750.
研究人员基于NN模型，研究了19种DNA寡聚体和9种DNA聚合物的热力学参数，获得了1M NaCl浓度下10种NN碱基的熵焓数据，可以用于计算Tm。
[5] Baldino Jr F, Chesselet M F, Lewis M E. High-resolution in situ hybridization histochemistry[M]//Methods in enzymology. Academic Press, 1989, 168: 761-777.
文章给出了长探针引物Tm的计算公式，提出了用16.6×lg[K+]来修正离子浓度，该调整为后来大多数研究引用。
[6] Rychlik W, Spencer W J, Rhoads R E. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro[J]. Nucleic acids research, 1990, 18(21): 6409-6412.
文章提出了一个计算最佳退火温度的公式，Ta=0.3×Tm(Primer)+0.7×Tm(Product)-14.9，公式将退火温度表示为引物和产物熔解温度的函数，是根据实验得到的经验公式。
[7] SantaLucia,, J., Allawi, H. T., & Seneviratne, P. A. (1996). Improved Nearest-Neighbor Parameters for Predicting DNA Duplex Stability†. Biochemistry, 35(11), 3555–3562.
作者通过测量寡核苷酸的Tm，然后通过公式（1）反推∆H、∆S、∆G，对NN碱基对的热力学参数进行校正。
[8] Sugimoto, N., Nakano, S. -i., Yoneyama, M., & Honda, K. -i. (1996). Improved Thermodynamic Parameters and Helix Initiation Factor to Predict Stability of DNA Duplexes. Nucleic Acids Research, 24(22), 4501–4505.
作者通过测量寡核苷酸的Tm，然后通过公式（1）反推∆H、∆S、∆G，对NN碱基对的热力学参数进行校正。
[9] Allawi H T, SantaLucia J. Thermodynamics and NMR of internal G⊙ T mismatches in DNA[J]. Biochemistry, 1997, 36(34): 10581-10594.
作者通过核磁共振研究了碱基对的熵焓参数，所得结果与Breslauer等的研究有一定差异，此外论文主要分析了，引物含有错配时的Tm及热力学参数，可用于预测含有错配碱基的退火温度。
[10] Owczarzy R, Vallone P M, Gallo F J, et al. Predicting sequence‐dependent melting stability of short duplex DNA oligomers[J]. Biopolymers: Original Research on Biomolecules, 1997, 44(3): 217-239.
作者Owczarzy在引物Tm方面有较深入的研究，本文主要对NN模型中的邻近序列的热力学参数进行修正，比较不同研究文献中的熵焓数据。
[11] von Ahsen N, Wittwer C T, Schütz E. Oligonucleotide melting temperatures under PCR conditions: nearest-neighbor corrections for Mg2+, deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas[J]. Clinical Chemistry, 2001, 47(11): 1956-1961.
作者们使用大量的探针引物评估了多种Tm计算公式，经统计分析，得到一个精度较高的计算公式，公式中Tm与单价离子浓度、GC%、引物长度、添加剂（DMSO等）有关，并且给出了Mg2+和dNTP与单价离子的浓度换算。
[12] Owczarzy R, You Y, Moreira B G, et al. Effects of sodium ions on DNA duplex oligomers: improved predictions of melting temperatures[J]. Biochemistry, 2004, 43(12): 3537-3554.
本文系统研究了92种DNA双链寡聚体的熔解温度，发现钠离子浓度范围为69 mM-1.02M时，Tm和ln[Na +]之间呈非线性关系，经过盐校正后，预测的Tm精度有明显的提高。
[13] Panjkovich A, Melo F. Comparison of different melting temperature calculation methods for short DNA sequences[J]. Bioinformatics, 2004, 21(6): 711-722.
作者用统计学的方法，选择了大量文献中Tm的数据，并比较了五种计算Tm的方法，然后作者将在给定长度和CG含量百分比下表现出相似行为的NN组计算的Tm值的平均值定义为Consensus Tm，Consensus Tm具有更高的精度。
[14] Wetmur J G. Nucleic acid hybrids, formation and structure of[J]. Reviews in Cell Biology and Molecular Medicine, 2006.
作者主要讨论了DNA:DNA, DNA:RNA, RNA:RNA双链的稳定性及其影响因素，具体包括双链结构的Tm计算公式，离子条件，熵焓数据，单双链平衡常数。
[15] Owczarzy, R., Moreira, B. G., You, Y., Behlke, M. A., & Walder, J. A. (2008). Predicting Stability of DNA Duplexes in Solutions Containing Magnesium and Monovalent Cations. Biochemistry, 47(19), 5336–5353.
Owczarzy等研究了Mg2+对引物Tm的影响，给出了Mg2+与单价阳离子的换算函数。
[16] Hecker K H, Roux K H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR[J]. Biotechniques, 1996, 20(3): 478-485.
作者介绍了通过降落或上升PCR提高产物特异性的方法。
[17] Korbie D J, Mattick J S. Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification[J]. Nature protocols, 2008, 3(9): 1452.
介绍了通过降落PCR提高产物特异性的方法及操作步骤。