生信 | 基因组组装实战（一）：基础知识与基本思路

2021-06-15 本文已影响0人生信卷王

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以下内容均来自菲沙基因（Frasergen）暑期生信培训班课堂笔记

1. Genome de nove 基础知识

➢ 基因组（Genome）

基因组就是物种所含有的一套遗传物质(单倍体细胞核、细胞器所含的全部DNA分子) , 包括全套基因和间隔序列。

基因组

➢ 基因组测序(Genome Sequencing)

➢基因组测序

利用测序技术对物种的体内的所有DNA分子进行测序,获取碱基组成,明确出基因的结构信息,外显子及内含子区域、启动子位置,以及基因的排列顺序及功能。

➢基因组测序技术

二代测序: 基于BGI平台的边合成边测序;
三代测序:基于PacBio平台的单分子实时测序。

➢基因组测序原理

通过对基因组DNA序列进行打断处理 ,制作成可以识别或读取的DNA形式及大小,利用荧光标记对每个碱基信号进行读取,进而获得DNA序列信息。

➢ 基因组从头测序(Genome de nove)

基因组de nove,又称为基因组从头测序,是指对基因组序列未知(或仅有基因组草图)的物种进行全基因组测序,然后进行拼装,从而得到该物种的全基因组序列,为后续功能基因挖掘、调控代谢网络构建、物种进化分析等奠定基础。
Genome

➢ 构建参考基因组 pipeline

构建参考基因组 pipeline

2. pipeline的功能简介

➢ 基因组 Survey 分析

基因组Survey基于小片段文库的低深度测序数据( 50X-100X ) ;
通过K-mer分析 ,有效的评估基因组大小、GC含量、杂合度以及重复序列的含量等信息;
是全面了解某一物种基因组特征的有效方法;
为后续的全基因组 de novo 测序的组装策略的制定提供理论依据。

Genome Survey
补充知识（一）：基因组复杂程度预估基因组复杂程度预估
补充知识（二）：根据K-mer图确认物种倍型

二倍体：杂合峰：主峰：重复峰 = 1:2:4（比值为横坐标峰的比值）

二倍体K-mer图 三倍体：正常情况下杂合峰：主峰：重复峰 = 1:2:3（左图）。主峰和重复峰深度低则可能重叠在一起：杂合峰：主峰：重复峰 = 1:2（右图）]

三倍体K-mer图 异源四倍体：2个峰，呈现1:2的关系

异源四倍体K-mer图 同源四倍体：同源四倍体的峰就是1 : 2 : 3 : 4 ,其中3和4经常重叠在一起

同源四倍体K-mer图

补充知识（三）：Survery的优势

Survery的优势

➢ 基因组组装与注释

基本概念与原理
Contig：使用短reads之间的overlap关系拼接所得的无GAP序列片段
Scaffold：通过大片段文库将Contig进-步连接所得的长序列片段，各个Contig之间用"N"填补
关系图
组装质量评价基本指标：ContigN50与SeaffoldN50
组装质量评价基本指标
将组装所得序列从大到小排列，并依次相加，当累加长度达到总长度一半时，最后一条序列的长度即为N50;一般来说，N50越大，组装结果的连续性越好
组装流程

组装流程

组装
常用软件有Canu, MECAT, FALCON。从项目周期、组装结果、资源消耗等方面综合来看,菲沙基因（Frasergen）他们首选Mecat 2进行基因组组装。
Hi-C辅助组装
Hi-C数据的一般规律:
➢ 染色体内的互作高于染色体间的互作
➢ 染色体内互作强度随线性距离增加而减弱

Hi-C辅助组装
组装结果评估

数据回比：为了评估组装的完整性和测序覆盖的均匀性,选择CLR (Continuous Long Reads) subreads ,使用比对工具Minimap2 ( v2.5默认参数)比对回组装好的基因组,统计reads的比对率、覆盖基因组的程度以及深度的分布情况,由此评估组装的完整性和测序覆盖的均匀性,结果如下表所示。数据回比结果
BUSCO评估：基于OrthoDB中的单拷贝同源基因集,使用BUSCO ( V3.0.2 )预测这些基因并统计其完整度,碎片化程度及可能的丢失率。由此评估整个组装结果中基因区的完整性(大于90%较好)。BUSCO评估结果如下表所示。 BUSCO评估
基因结构注释
基因结构预测包括预测基因组中的基因位点、开放性阅读框架（ORF）、翻译起始位点和终止位点、内含子和外显子区域、启动子和终止子、可变剪切位点以及蛋白编码序列（CDS）等

真核基因结构
基因功能注释
全基因组测序将产生大量数据，此前普遍采用比对方法对对预测出来的编码基因进行功能注释，通过与各种功能数据库（NR、Swiss-Prot 、GO、KOG、KEGG）进行蛋白质比对，获取该基因的功能信息。其中GO和KEGG数据库分别在基因功能和代谢通路研究中占据重要地位。

基因功能注释
非编码RNA注释
非编码RNA（ncRNA），指不翻译成蛋白质的RNA，如
miRNA(MicroRNA),
tRNA(转运RNA)，
rRNA(核糖体RNA),
snRNA（小核RNA）等。
利用tRNAscan-SE对全基因组进行tRNA预测；利用RNAmmer预测全基因的rRNA；利用Rfam数据库通过cmscan鉴定全基因组非编码RNA

非编码RNA
重复序列分析
重复序列广泛存在于真核生物基因组中，这些重复序列或集中成簇，或分散在基因之间，根据分布把重复序列分为分散重复序列（Interpersed repeat）和串联重复序列（Tendam repeat）

重复序列分析
基因组圈图结果展示基因组圈图