NGS原理- 单细胞转录组测序-横评 CEL-seq2, Dro
【转载】自 PLOB单细胞RNA测序方案比较
目前，随着单细胞RNA测序技术（scRNA）的成熟，新的测序方案不断出现。那么，各种技术平台的性能如何呢？优缺点有哪些呢？如何根据我们的研究目的选择合理的单细胞RNA测序技术呢？
本文系统的比较了6种主流的单细胞RNA测序方法：CEL-seq2, Drop-seq, MARS-seq, SCRBseq, Smart-seq和Smart-seq2，从而为我们合理的选择技术平台、设计实验方案提供参考。
scRNA测序方法介绍
6种测序方法都是通过捕获mRNA的3`段polyA进行反转录、扩增、建库和测序。
单独介绍单细胞测序方法
NGS原理- 单细胞转录组测序-介绍CEL-seq2, Drop-seq, SCRBseq, Smart-seq
主要的区别在于Smart-seq/C1和Smart-seq2为基于full length的测序方案，而其余的四种为基于unique molecular identifiers (UMIs)的测序方案；
其中，前者对整条转录本进行测序，后者仅对转录本的一段序列进行测序
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实验材料
583个小鼠的胚胎干细胞（mESCs），该细胞培养于有两种抑制剂的环境中，从而获得一致性相对较好的细胞群体。
同时，建库时添加已知浓度的92种外源RNA分子（External RNA Control Consortium，ERCCs)。对每一种技术，进行两次重复建库。
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结果分析
1）QC
首先，作者对各个平台的测序质量进行评估。从比对率来看，6个平台均超过了50%；且对于全长的测序方案而言，smart-seq有30%，smart-seq2有48%的reads比对到了外显子区域。
对于UMI模型的平台，外显子区域的reads比例则低于15%（下图）;表明full length和UMI模型的测序有较大的差异。
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对测序深度的评估主要采用下抽样的饱和度分析，结果表明当reads number>100万时，可以达到饱和，与其他的研究结果一致（下图）。
Commet: 我个人觉得1M reads达到饱和还是有点困难，
横轴如果放到10Mreads，还能体现出饱和的曲线，这样才可靠一些。
目这样看，起码SCRB-seq，Drop-seq明显没有饱和，说达到还是不太合适的
有空会补充一下这方面东西看看。
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2）敏感度评估
在单细胞RNA测序中，一个主要的问题就是drop out效应；所谓drop out效应，就是细胞中实际有某基因的表达但是检测结果为零表达。
因此，单细胞测序评估对基因表达（mRNA）的捕获效率，即敏感度（sensitivity），是一个重要的技术指标。
通常敏感度的评估指对相同的实验材料在相同的测序深度下，单个细胞检测的基因表达数量。
结果表明,Smart-seq2的敏感度最高(中位数9,138/cell)，Drop-seq和MARS-seq的敏感度最低，中位数分别为4,811/cell 和 4,763/cell（下图）。
还没看原文，测序深度设定多少
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为了评估在多个细胞中检测到的基因总数差异，对每种方法将65个细胞的reads合在一起分析，结果发现19000个基因 for CEL-Seq2/C1, 17000 for MARS-seq, 18000 for Drop-seq、SCRB-Seq, 20000 for Smart-seq/C1, 21000 for Smart-seq2；
同时发现，大部分的基因(13000)可以被6种方法检测到，但是full length特异性的基因数目（1000）要大于3`段特异性基因的数目（300）。同时表明，总的检测细胞数目与基因数成正比（下图）。
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3）scRNA-Seq的准确度评估
为了评估各个方法对基因表达定量的准确性（Accuracy），对92个外源的ERCC转录本，采用线性模型拟合了观测的表达值（counts per million or UMIs per million）与已知的浓度的相关系数(R2)；
结果表明，各个方法的相关系数均较高，从0.83 (MARS-seq) 到 0.91 (Smart-seq2)不等，但是Kruskal-Wallis检验表明各个方法之间有显著的差异（p < 2.2e16）（下图）。
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4）基因扩增的精确度评估
所谓Precision，可以简单的认为基因表达水平估计的重现率。由于本实验的细胞和条件的一致性，因此各个方法得到结果差异理论上均来源于技术差异（technical variation），而非生物学差异（biological variation）。
单细胞的技术差异主要来源于两个方面：捕获时的drop out效应以及扩增时的偏好性。这里，有13,361个基因在25%的细胞中被至少一种方法检测到了表达，然后挑选65个细胞对这些基因进行分析。
dropout分析发现，MARS-seq具有最高的中位dropout概率（74%），而Smart-seq2则最低（26%），这也与之前的敏感度分析结果一致（下图）
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而对扩增的变异系数分析发现，如果以reads来定量，则smart-seq2的变异系数最小；而如果采用UMI定量，则可以显著的减少变异系数（下图），表明UMI技术在定量的准确性上更具有优势。
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5）综合效能（power）的评估
为了评估各个方法对差异基因发现的效能（power）,作者通过模拟的方法使两组细胞的13,361个基因中的5%有表达差异，然后采用limma进行差异分析，并计算真阳性率（TPR）和假阳性率（FPR）。
首先评估细胞数量对TPR和FPR的影响（每个细胞100万条reads）,结果见下图，表明每组的细胞数>64后真阳性率开始比较稳定。
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继而，在64 cell/group和100万 reads/cell的条件下，分别比较了基于reads 和UMI的差异分析，结果表明smart-seq2在基于reads的条件下有最好的结果，而其他的方法采用UMI 则效果也会有较大的提升。
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而对100万的reads下抽样至50万和25万也表明随着reads数的下降，真阳性率也降低（下图）。
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6）性价比评估
基于各个技术的敏感度、准确度、精确度和效能，我们可以选择合适的技术平台。但是，测多少细胞，测多少reads，仍有一个重要的考量，就是实验成本。
作者统计了6种方法的单价（下表）。总之，实验方案的设计需要同时考虑技术和成本问题，当然，土豪可以忽略钱。
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总结
单细胞RNA研究中考虑的三个主要问题是：1）full length 还是UMI ？2）cell number；3）sequencing reads number。其主要是根据我们的研究目的而定。
目前来看，细胞图谱类的研究由于要测大量的细胞（>10,000）,因此常采用UMI的方法(drop-seq)，测序深度约为100万 reads/cell；该类研究主要是细胞分类和marker基因的鉴定，因此UMI的信息是足够的。
而对于其他的研究，如果想获得更多的信息，则采用smart-seq2的全长模式比较合适，建议测序深度加高，以便可以得到如lncRNA、miRAN和可变剪接（Alternative Splice）等更多的生物信息。
参考文献：
Ziegenhain C, Vieth B, Parekh S, et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods[J]. Molecular Cell, 2017, 65(4):631-643.e4.
