非因TALK | 非因生物DSP空间多组学助力胰腺癌生物标志物鉴
研究背景
胰腺癌(PC)是一个预后差、死亡率高的恶性肿瘤。手术切除是唯一“有效的”治疗方式。然而，只有少数胰腺癌患者可以接受手术治疗。提高PC患者的总生存期（OS）仍然是一个重大挑战。生物标志物是诊断和预测PC的一个重要方法。已经为新诊断为可手术的PC患者或者晚期和转移的PC患者开发了一些预测模型，然而这些模型需要进一步验证。因此，迫切需要探索新的生物标志物，对高危PC患者的筛查产生有临床意义的影响。
研究目的
为了提升预测PC患者的无病生存期（DFS）、总生存期（OS）和免疫治疗的敏感性能力，并改善PC的预后。2022年4月郑州大学第一附属医院血液科李威等人在《Molecular Medicine》（IF：5.7）杂志上发表题为“Identification and prognostic analysis of biomarkers to predict the progression of pancreatic cancer patients”的研究性论文（图a）。
本研究利用DSP-CTA（DSP空间多组学癌症转录图谱）技术对PC患者的癌组织和癌旁组织进行了1833个RNA靶点的分析，确定了癌组织和癌旁组织之间的五个差异表达标志物（LAMB3, FN1, KRT17, KRT19和ANXA1）。然后通过癌症基因组图谱(TCGA)数据库证实差异表达标志物的表达模式。最后，采用生存分析（survival analysis)、单变量和多变量Cox比例风险模型、风险模型分析(risk model analysis)和免疫检查点阻断剂（immune checkpoint blockade，ICB）分析来证实这些标志物在PC中的预测作用。研究表明，LAMB3, FN1, KRT19和ANXA1是PC预后良好的预测因子。同时，FN1和ANXA1可以作为PC免疫治疗的预测因子。该文章利用的DSP-CTA技术由非因生物提供。
图a
研究思路
研究结果
1.通过H&E染色确定PC患者的癌组织和癌旁组织
为了生成PC组织切片的无偏转录图谱，研究团队利用H& E染色对PC患者的冷冻组织切片进行了癌组织（001-012，图1D）和癌旁组织（5个癌组织001、002、003、004和011以及正常组织005、006、007、008、009和010，图1C）的划分和圈选（图1A），同时发现红色圈出的癌旁组织在形态上与癌组织相似，说明癌旁组织同时含有正常和癌组织（图1B）。
图1
2.通过DSP分析比较癌组织和癌旁组织的差异表达基因
为了筛选出癌组织和癌旁组织之间的差异表达基因，研究团队利用tSNE分析将所有ROI聚为3类（图2A），研究发现来自癌旁组织的ROI（001、002、003、004和011）和癌组织的ROI（001-007）聚为一类，这与H& E染色结果一致。然后研究者再次对有和无差异的ROI分别进行PCA聚类，比较差异表达的基因（图2B和C），结果与PCA分析结果一致，差异ROI间有显著上调和下调的基因（图2E）；无差异的ROI之间未鉴定到差异表达基因（图2F）。进一步证实来自癌旁组织的ROI（001、002、003、004和011）是癌组织。
紧接着，研究团队分析了癌旁组织和癌组织之间差异表达量最高的5个基因：LAMB3、FN1、KRT17、KRT19和ANXA1(图2G和H)。癌组织的KEGG通路富集分析包括层粘连蛋白相互作用、细胞外基质降解、细胞外基质组织等通路与上调基因高度相关(图2I和J)。综上，研究团队利用DSP-CTA技术在PC组织中鉴定了5个高选择性表达基因。
图2
3.生存分析表明LAMB3、FN1、KRT17、KRT19和ANXA1对胰腺癌预后有显著影响
为了明确LAMB3、FN1、KRT17、KRT19和ANXA1五个基因在PC中的作用，研究者利用TCGA数据库的178名PC患者验证了LAMB3、FN1、KRT17、KRT19和ANXA1的表达模式，并根据表达水平将LAMB3、FN1、KRT17、KRT19和ANXA1划分为高表达组和低表达组。与邻近组织（N=4）和正常组织（N=328）相比，LAMB3、FN1、KRT17、KRT19和ANXA1都明显上调（图3A）。采用K-M生存分析和log-rank检验比较LAMB3、FN1、KAR17、KAR19和ANXA1高表达和低表达时DFS和OS的差异，结果表明，LAMB3、FN1、KRT19和ANXA1高表达组表现出较短的DFS。而基于KAR17的高表达和低表达，DFS和OS都没有明显差异（图3B和C）。
图3
4.单变量和多变量Cox比例风险模型
随后，研究者利用单变量和多变量Cox分析评估了LAMB3、FN1、KRT19和ANXA1对PC患者DFS和OS的独立预后价值。单变量分析表明，LAMB3、FN1、KRT19和ANXA1高表达组与较短的DFS（图4A）和OS（图5A）明显相关。多变量分析显示，LAMB3、FN1、KRT19和ANXA1高表达组与PC患者明显较短的DFS（图4B）和OS（图5B）独立相关，这可以作为PC的独立预后因素。
图4
图5
5.根据LAMB3、FN1、KRT19和ANXA1构建并验证PC患者的风险模型
研究者根据LAMB3、FN1、KRT19和ANXA1在PC患者中的表达情况，构建并验证了一个风险模型（LASSO Cox regression），该模型可以有效识别大部分可用的预测标志物，并产生预测临床结局的预后指标。研究者首先分析了LAMB3、FN1、KRT19和ANXA1在预测PC患者DFS方面的预后作用。LAMB3、FN1、KRT19和ANXA1所选特征的系数通过lambda参数表示(图6A)。根据“survminer” R软件包分析得到的中位点，将PC患者分为低风险组（n=89）和高风险组（n=89）（图6C顶部）。生存分析显示，高风险组的DFS短于低风险组(P=0.0004;图6D)。这个发现表明LAMB3、FN1、KRT19和ANXA1联合预测具有较高的预后价值(图6E)。使用相同的分析方法，研究者验证了LAMB3、FN1、KRT19和ANXA1对PC患者OS的预测作用，仅选择LAMB3、KRT19和ANXA1进行OS的多变量分析(图6F和G)。基于LAMB3、KRT19和ANXA1的联合表达，显示低风险组的OS比高风险组更长（图6I）。这表明LAMB3、KRT19和ANXA1联合表达对PC患者OS的预后价值(图6J)。
图6
6.基于LAMB3、FN1、KRT19和ANXA1的高低表达，分析PC患者的ICB的响应
为了评估ICB在治疗癌症患者中的临床作用，研究者根据LAMB3、FN1、KRT19和ANXA1的高低表达，评估了89名接受ICB治疗的PC患者的TIDE（肿瘤免疫功能紊乱和排斥）评分。研究发现，与FN1（图7B）或ANXA1（图7D）低表达组相比，高表达组与较高的TIDE评分一致。而且，较高的TIDE得分与较低的ICB响应相关。相反，基于LAMB3（图7A）或KRT19（图7C）表达的TIDE评分无显著差异。
接着，研究者比较了基于FN1或ANXA1表达的免疫检查点的表达。研究发现，与FN1的低表达相比，FN1高表达的 PC患者的PDCD1LG1、CTLA4、TIM3、LAG3、PDCD1LG2和TIGIT的表达更高（图7E）。同样，ANXA1高表达的PC患者的免疫检查点也存在类似的表达模式（图7F）。综上所述，FN1或ANXA1表达可预测PC患者对ICB的响应。
图7
7.基于LAMB3、FN1、KRT19或ANXA1高低表达的差异表达基因及KEGG通路分析
鉴于LAMB3、FN1、KRT19和ANXA1可以作为PC的预后生物标志物，研究者最终分析了LAMB3、FN1、KRT19和ANXA1高表达PC患者和低表达PC患者的转录表达差异。火山图显示，与LAMB3低表达组相比，LAMB3高表达组有433个上调基因和89个下调基因（图S2A）。同时对LAMB3高表达和低表达组进行KEGG通路的富集（图S2B和C）。同样，与FN1低表达组相比，FN1高表达组有387个上调基因和7个下调基因（S2D）。FN1高表达组中KEGG通路的富集如图S2E。与KRT19低表达组相比，KRT19高表达组共鉴定出443个上调基因和87个下调基因（图S2F），此外KRT19高低表达组中KEGG通路富集与LAMB3高低表达组相似（图S2G和H）。最后，与ANXA1低表达组相比，ANXA1高表达组中有223个基因上调，45个基因下调（图S2I），ANXA1高低表达组的KEGG通路富集见图S2J和K。
图S2
文章总结
研究团队首先提出了对肿瘤、肿瘤微环境和肿瘤免疫反应的全面剖析，通过DSP-CTA癌症转录图谱的1833个靶标发现PC组织中有5个显著上调的标志物（LAMB3, FN1, KRT17, KRT19和ANXA1）。使用多种分析方法（包括生存分析、单变量分析、多变量Cox比例危害模型和免疫分析）验证五个标志物在PC的DFS和OS中的预后作用。最后得出结论，LAMB3, FN1, KRT19和ANXA1联合是预测PC预后有效指标。同时，FN1和ANXA1可以作为PC免疫治疗效果的指标。
