【基因组】组装及原理
sequence assembly
1. DNA测序技术
第一代：sanger
第二代：高通量 illumina， 454测序，等
2.5代：lon torrent/proton 测序
第三代：pacbio
2.mate-pair（大长度） 文库的构建
≥2k 片段→加接头→环化→打断→短片段→回收带标记的片段对较短的片段进行测序
3. 各测序平台特性
Illumina
reads：49-300bp
错误率 1%左右，3‘端会高一点
pair-end文库（170-40kb）
数据格式 4行：（fastq）
- reads id，@开头
- 序列信息，N代表不确定
- 质量值的id，一般和 reads 的 id 相同
- 质量值的信息（ASCII 码-64 = 质量值）
成对的 reads 对应的行号是一样的。
454
reads：700bp（peak），平均 500
error and indel 错误
pair-end 1kb-20kb
数据格式：
- 序列信息：fasta格式，> 开头 id
- 质量信息：存放于另一个文件中，> 号开头，直接用数值表示
4. 组装的基本思路
策略1：
分级组装：人类基因组
缺点：实验环节较慢，需要图谱，消耗高
优点：算法简单，质量高
策略2：
鸟枪法（whole-genome shotgun）：
优点：实验简单，花费低
缺点：计算能力要求，质量低
5. 基本概念
overlap：重合部分
contig：组装的初级序列
pair-end：中间有未知的区域
scaffold：
6. 基因组大小的估计
流式细胞仪
Kmer 分析
根据近源物种估计，得到基础值，得到一些测序数据，利用Kmer估计
1. 泊松分布 poisson distribution
测序深度：基因组中每个碱基被测序的频率。一般情况下，个体测序：30 层
假设基因组大小为G，随机测序，read 的长度为L，当生成一个read 的时候，一个固定碱基被测到的概率是 L/G， reads 的总量为n_r.
L/G 非常小，而 n_r 非常大，每个碱基被测到的频率的期望：
d_n = L/G * n_r
它服从泊松分布（n 很大而 p 很小的二项分布）。
Kmer：固定长度的核苷酸序列，奇数（避免正反链一致，中间的肯定不一样）
假设基因组中 K 是独一无二的，则 G 大小的基因组中的 Kmer 的数量也为G，reads 的长度为 L，则一个固定的 Kmer 被测到的概率为（L- K + 1）/G（因为L上可以有L-K+1个Kmer）。
L-K+1/G 很小，而 n_r 非常大，每个Kmer被测到的频率的期望和总个数：
d_k = (L-K+1)/G * n_r
n_k = (L-K+1) * n_r
可推导出：
G = n_k/d_k
d_n/d_k = L/(L-K+1)
image.png
图片为，reads为100时，Kmer长度为25，在d_n 为 40时， d_k 为30.4。
100/(100-25+1) * 40 = 30.4
基因组大小 G = n_k/d_k
7. Kmer 的其他应用
下图为一个比较简单的基因组的Kmer分布
image.png
下面较复杂：
最前面：测序错误造成。
两个峰值：一个峰高，一个峰低（高杂合基因组造成，深度正好差一倍）。
尾部：由于重复片段造成的。
image.png
下面：
同样两个峰，80处有个小峰，基因组带有高重复率，但是杂合度不高。
image.png
Kmer在组装上的应用
组装基于 Kmer 而非 reads
长度为17的Kmer，相邻有16bp是相同的。
read 上的Kmer数： L-K+1
8. 基于二代测序结果的组装
一些名词：
image.png
Illumina
原理：根据Kmer（Kmer 图）
软件：SOAPdenovo（华大）、velvet ABySS、ALLPATH-LG
以SOAPdenovo为例：
-
构建图（De bruijn graph）
image.png
中间的数字显示出现的次数
image.png
- 简化图，并获得contigs
去掉低频kmer链接（测序错误造成的）
利用各种方法去掉其他的错误
最终使 reads 连接成为 contigs - 将 pair-end mapping 到 contigs 上
a. 将pair-end 定位到 contigs（完整的序列（长于Kmer），存在于reads和contig上）
b. 测序方向的问题。
c. 估计gap的大小，用 N 填充。 - 构建 scaffolds
- pair-end 中间 gap 的填充（延伸contig）
a. 利用pair-end 的数据
b. 长reads可以跨过洞
sanger/454测序
方法：overlap-layout-consensus
代表软件：Newber、Celera、Phrap
高杂合基因组
fosmid 文库 + 鸟枪法（牡蛎为例），花费高，周期长
BAC克隆（华大） + 鸟枪法，花费高，周期长
Ultra-Deep de novo，高深度测序 （下一节），花费少，效果差，周期短
9. 高深度测序原理及方法
利用Kmer分布图（峰），识别出 unique Kmer 和 repeat Kmer
image.png
10. 影响组装的因素
1. 测序错误
N太多（超过 10%，5%，3%，视数据多少而定），去掉
测序质量
接头序列，reads和接头比对
小的 insert size
去除 PCR duplication
测序错误引起的问题
Kmer 峰的前移
纠正
包含错误位点的Kmer出现的频率低，识别出，一次替换为其他三个碱基，直至Kmer的出现频率变高。
为了不人为改变造成错误，一般一个reads只改一个
先纠错 再进行 contigs 的组装
2. 重复序列
N50和N90 推测影响
3. 杂合
N50和N90 推测影响
如果杂合度超过千分之5，就要考虑是否考虑 高深度测序等。
11. 辅助组装的技术
- Fosmid-end/ BAC-end
- 遗传图谱和物理图谱
- optical mapping，酶切，获得片段长度，辅助组装
- The Irys System (BioNano)，密度高
可以侦测 gap 的大小及错误的插入
尽量将组装结果，连接到假染色体上。
12. 评价基因组
基于长度
N50：contigs从长到短排序，累加到总长50及以上是，那个conig的长度。
N90：同理
genome 的覆盖度（80%以上）
基于准确度
与EST 或 转录组数据 比对
golden standard （比如 fosmid 等）
同源方法，与同源物种或模式生物比较基因模式
GC 深度和 测序深度的分析
下图，红圈部分，可能是y染色体
image.png
下图，红圈部分，左右两端的小圈区域，GC高的部分可能是细菌污染（可以过滤掉相关reads）
image.png
image.png
gap 可能的产生原因：repeat 造成的深度高
基因颠倒，证明是否正确
基因结构预测，与近源物种比较
13 SOAPdenovo 组装流程
1. 下机数据准备
后有index，用于区分样品
质量值：Q = -10 log10P，ASCII码，减64
PE（pair-end） reads：成对的reads（paired-end reads 和 mate-pair reads）
SE（single-end） reads
2. 过滤，数据质控
Q20，占全部碱基的80以上。
过滤 adaptor：fastq转化为fasta，利用nucmer将接头序列与reads相比较，过滤掉adaptor（SOAPfilter）
过滤低质量的reads：
N 占太多的 过滤掉（10%）
过滤掉 small insert 的 reads
两端的碱基准确率可能较低（两个reads，A,T不相等），可以剪掉
3. 下机数据纠错
KmerFraq_AR_ 软件
-K 设置成17，可以估计出小于16G的基因组
关注最后一个文件，标记各种kmer选项。
4. 基因组大小和杂合度的估计
需要软件
命令：./KmerFreq_AR_v2.0 -k 17 -t 4 -p species fq.lst
5. SOAPdenovo
配制文件，格式在官网上有介绍
avg_ins： 插入片段的长度
reverse_seq：是否环化，0 或 1
... ...
